Un système de Microbiomechanical pour l’étude de la Formation de varicosité et récupération dans les axones des neurones centraux
Summary
Ce protocole décrit une approche fluide pressurisée physiologiquement pertinente pour l’induction rapide et réversible de varicosités dans les neurones.
Abstract
Varicosités axonales sont des structures élargies sur les arbres des axones avec un haut degré d’hétérogénéité. Ils sont présents dans le cerveau avec des blessures ou de maladies neurodégénératives, mais aussi dans le cerveau normal. Nous décrivons ici un système nouvellement créé micromécaniques pour rapide, fiable et réversible induisent des varicosités axonales, ce qui nous permet de comprendre les mécanismes qui régissent la formation varicosité et composition en protéines hétérogènes. Ce système représente un moyen novateur d’évaluer les effets des contraintes de compression et de cisaillement sur les différents compartiments subcellulaires des neurones, différents des autres systèmes in vitro qui portent principalement sur l’effet de l’étirement. Ce qui est important, en raison des particularités de notre système, nous avons récemment fait une découverte montrant que l’application du fluide sous pression peut rapidement et de façon réversible induire axonales varicosités par l’activation d’un canal de potentiel récepteur transitoire. Notre système biomécanique peut être idéalement utilisé en combinaison avec la perfusion de médicaments, l’imagerie de cellules vivantes, imagerie calcique et enregistrement de patch clamp. Par conséquent, cette méthode peut adopter pour l’étude des canaux ioniques mécanosensibles, règlement transport axonal, dynamique du cytosquelette axonal, calcium de signalisation et les changements morphologiques liés à un traumatisme crânien.
Introduction
Varicosité formation, ou gonflement/perler, le long des axones, est une caractéristique importante de la neurodégénérescence observée dans de nombreux troubles ou de lésions du système nerveux central, y compris la sclérose en plaques, maladie d’Alzheimer, de Parkinson et traumatique Brain injury1,2. Malgré les impacts physiologiques importantes de varicosités axonales sur la propagation du potentiel d’action et de la transmission synaptique3, comment naissent les varicosités reste inconnue. Récemment, à un dosage microbiomechanical nouvellement créé sur les neurones hippocampal cultivés contre les rongeurs, nous avons constaté que des stimuli mécaniques peuvent induire des varicosités dans ces neurones avec intriguant très caractéristiques. Tout d’abord, l’induction de la varicosité est rapide (< 10 s) et ce processus est réversible de façon inattendue. Deuxièmement, initiation varicosité dépend de la puissance soufflant la pression : plus la pression, plus vite l’initiation. En troisième lieu, initiation varicosité dépend de l’âge neuronale. Les axones des neurones plus jeunes semblent plus sensibles aux contraintes mécaniques, comparées à celles des neurones plus âgés. Quatrièmement, la forme de varicosités le long des axones des neurones de l’hippocampe, tandis que les dendrites et les segments de l’axone initiale de ces neurones n’afficher aucun changement dans les mêmes conditions de bouffées. Ainsi, notre étude a révélé une nouveauté de la polarité neuronale. Ces résultats avec le système in vitro sont physiologiquement pertinents. À l’aide d’un modèle in vivo pour léger traumatisme crânien léger (TCL), nous a montré que les varicosités axonales élaboré d’une manière multi-focale dans le cortex somatosensoriel des souris immédiatement après le choc de clôture-crâne, conforme à notre in vitro résultats4. Il est important de noter que notre coloration et d’imagerie des souris TCCL fournissent seulement un instantané des changements morphologiques neuronales, depuis l’exécution en vivo imagerie Time-lapse de la morphologie neuronale lors d’un impact mécanique n’est toujours pas réalisable.
Ce système fluide-bouffant nous a permis non seulement de capturer les particularités associées à la formation mécanique varicosité induite par le stress, mais aussi de déterminer le mécanisme sous-jacent. En testant différentes solutions extracellulaires, les bloqueurs et les ouvreurs de différents candidats des canaux ioniques mécanosensibles et de l’électrophysiologie cellulaire, nous avons identifié que le cation potentiel récepteur transitoire canal membre du subfamily V 4 (TRPV4) canal est perméable aux Ca2 + et Na+ et activables par bouffées est principalement responsable de la détection des contraintes mécaniques initiales au cours de la varicosité axonale formation4. Ceci a été confirmé plus loin avec une approche d’élimination directe de siARN. Pris ensemble, ce nouveau système de test, que nous avons mis au point avec la culture de neurones hippocampiques, est très précieux pour l’étude des propriétés de micromécanique des neurones centraux, en particulier en combinaison avec d’autres techniques.
Ce système de micromécanique, que nous avons mis en place est unique et diffère des systèmes déjà existants sous plusieurs aspects importants. Tout d’abord, dans ce système, les neurones expérience hors-plan des contraintes mécaniques dans les formes de compression et de cisaillement. Lors de l’impact mécanique, processus neuronaux restent attachées à la surface de la lamelle couvre-objet et ne bougent pas. Cela diffère des autres systèmes qui occupe principalement la flexion et l’extension dans le plan expérimental (ou tension), par exemple, la déviation des axones groupés comme se déplaçant chaînes5,6 ou l’étirement des axones cultivés sur micromotifs canaux et membranes extensible7,8. En outre, même si les varicosités axonales peuvent également être induites dans ces épreuves comme dans notre système fluide-bouffant, le processus dans ces milieux prend beaucoup plus de temps (à partir de 10 min à plusieurs heures6,7,8) et apparaît irréversibles. Enfin, notre système à l’aide locale fluide soufflant permet l’examen des caractéristiques spatiales de formation varicosité (e.g., dendrites, des épines dendritiques, soma, axonales segments initiaux bornes axonales), outre ses caractéristiques temporelles. Grâce à ce système, nous avons découvert plusieurs fonctionnalités inattendues et uniques de formation de varicosité axonale, surtout un début rapide, lente réversibilité et polarité axon-dendrite.
Le système que nous discutons dans cet article est compatible avec nombreuses techniques de moléculaire et biologie cellulaire. Par exemple, pour étudier les effets du stress mécanique sur la morphologie neuronale et la fonction, il peut être utilisé avec la co-culture de myelin, Time-lapse d’imagerie de fluorescence (FRBR), de la réflexion totale interne et de transfert d’énergie de fluorescence de résonance (FRET) imagerie calcique et enregistrement de patch clamp. Dans cet article, nous nous concentrons sur les composants principaux du système. Culture de neurones hippocampiques, le fluide-bouffées d’installation, une imagerie Time-lapse pour le transport axonal et imagerie calcique sont illustrées étape par étape ci-dessous.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procédure de ce test de microbiomechanical est simple. Il va produire des résultats fiables, si toutes ses étapes sont réalisées avec soin. Il y a plusieurs étapes clés qui, si mal exécutée, vont entraver la collecte de données réussie. Les étapes critiques commencent en amont de la demande réelle du stimulus bouffée. Dissection minutieuse, culture et soins de la culture de neurones primaires sont primordiaux. Si les neurones en culture ne sont pas en bonne santé, ils ne réagiront pas systématiquement…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Toutes les expériences sur des animaux ont été menées selon le National Institutes of Health Animal usage Guidelines. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du National Institutes of Health (R01NS093073 et R21AA024873) de C. Gu.
Materials
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
Riferimenti
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