Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca2 +-imaging und Degranulation Assays
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu isolieren und kultivieren murinen peritonealen Mastzellen. Wir beschreiben auch zwei Protokolle für ihre funktionelle Charakterisierung: eine fluoreszierende Imaging der intrazellulären freien Ca2 + Konzentration und eine Degranulation Assay anhand der kolorimetrischen Quantifizierung der veröffentlichten β-Hexosaminidase.
Abstract
Mastzellen (MCs), Rolle als Teil des Immunsystems, eine zentrale bei der Verteidigung der Gastgeber gegen mehrere Krankheitserreger und bei der Auslösung der allergischen Immunantwort. Die Aktivierung des MCs über die Vernetzung der Oberfläche IgE, hohe Affinität IgE-Rezeptoren (FcεRI) sowie durch die Stimulation von mehreren anderen Rezeptoren gebunden, initiiert den Aufstieg des freien intrazellulären Ca2 + Levels ([Ca2 +]ich) Das fördert die Freisetzung von entzündlichen und allergischen Mediatoren. Die Identifizierung von molekularen Bestandteile dieser Signalwege beteiligt ist entscheidend für das Verständnis der Verordnung der MC-Funktion. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung von murinen Bindegewebe Typ MCs von peritoneal Lavage und Anbau von peritonealen MCs (PMCs). Kulturen von MCs aus verschiedenen Knockout-Maus-Modellen durch diese Methode darstellen einen sinnvoller Ansatz zur Identifizierung von Proteinen in MC Signalwege beteiligt. Darüber hinaus wir auch beschreiben ein Protokoll für die einzelne Zelle Fura-2 imaging wie eine wichtige Technik für die Quantifizierung von Ca2 + Signalisierung in MCs. Fluoreszenz-basierte Überwachung [Ca2 +]ich ein zuverlässiges und gängigen Ansatz zur studieren Sie Ca2 + Veranstaltungen, darunter Kalzium Shop betrieben Eintrag, die von größter Bedeutung für die MC-Aktivierung-Signalisierung. Für die Analyse von MC Degranulation beschreiben wir einen β-Hexosaminidase-Release-Assay. Die Höhe der β-Hexosaminidase in das Kulturmedium abgegeben wird als Degranulation Marker für alle drei verschiedenen sekretorischen Teilmengen in MCs. β-Hexosaminidase beschrieben durch seine Reaktion mit einem Colorigenic Substrat in leicht quantifizierbar sind ein Mikrotiter-Platte kolorimetrischen Probe. Diese hoch reproduzierbare Technik ist kostengünstiger und erfordert keine spezielle Ausrüstung. Das angegebene Protokoll zeigt insgesamt eine hohe Ausbeute von MCs typischen oberflächenmarker MC zum Ausdruck zu bringen, anzeigen typischen morphologischen und phänotypischen Merkmale der MCs und hoch reproduzierbare Reaktionen auf Secretagogues in Ca2 +– Nachweis Bildgebung und Degranulation Assays.
Introduction
MCs spielen eine herausragende Rolle bei angeborenen und erworbenen Immunantwort. Insbesondere MCs teilnehmen an der Tötung von Krankheitserreger wie Bakterien und Parasiten, und auch potentiell toxischen endogene Peptide oder Komponenten der Gifte (für Überprüfung siehe Galli Et Al. 20081) abgebaut. Die physiologische Rolle von MCs in angeborenen und der adaptiven Immunität ist Gegenstand hitziger Debatten. Daher erfordern zahlreiche Daten Diskrepanzen in den Studien mit verschiedenen MC-defizienten Maus-Modellen eine systematische Neubewertung der immunologischen Funktionen von MCs über Allergie2. Reife MCs sind meistens in Geweben und Organen wie Darm, Haut und Lunge beschränkt und sind in der Regel nur in geringen Stückzahlen im Blut gefunden. MCs stammen aus hämatopoetischen Vorläufer, wie z. B. MC Stammväter, und füllen Sie ihre Differenzierung und Reifung in die Mikroumgebungen von fast allen vaskularisierte Gewebe1. T-Cell-derived Factor Interleukin (IL)-3 fördert gezielt die Lebensfähigkeit, Proliferation und Differenzierung von pluripotenten Einwohner Maus MCs aus ihrer hämatopoetischen Vorläuferzellen3. Stem Cell Factor (SCF) entsteht durch strukturelle Zellen in den Geweben und spielt eine entscheidende Rolle in der MC-Entwicklung, überleben, Migration und Funktion4. Die Eigenschaften der einzelnen MCs können je nach ihrer Fähigkeit zu synthetisieren und verschiedenen Proteasen oder Proteoglykane zu speichern. Bei Mäusen sind die so genannten Bindegewebe-Typ MCs von Schleimhaut MCs entsprechend ihrer anatomischen Lokalisation, Morphologie und Inhalte von Heparin und Proteasen5unterscheiden.
In MCs, ein Anstieg von freien cytosolischen Ca2 + ([Ca2 +]ich) ist unentbehrlich für die Degranulation und Produktion von Eicosanoids sowie für die Synthese von Zytokinen und Aktivierung von Transkriptionsfaktoren in Reaktion auf Antigen und verschiedenen Secretagogues6. Eine nachgeschaltete Hauptziel dieser Reize ist Phospholipase C, die Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-Trisphosphate hydrolysiert. DAG aktiviert Proteinkinase C und IP3 gibt Ionen von Ca2 + aus dem endoplasmatischen Retikulum frei. Raubbau an diesen Geschäften aktiviert Ca2 + Zustrom durch Plasmamembran Ca2 + Kanäle, was zu betriebenen Kalzium Eintrag (SOCE) speichern. Dieser Prozess wird hervorgerufen durch das Zusammenspiel von Ca2 +-Sensor, Stromale Interaktion Molekül-1 (Stim1), in dem endoplasmatischen Retikulum mit Orai17 sowie durch die Aktivierung von Transienten Rezeptor potenzielle kanonische (TRPC) Kanal Proteine (für Überprüfung siehe Freichel Et al. 2014-8) in der Plasmamembran.
Zur Untersuchung werden die physiologische Rolle dieser Kanäle, mehrere pharmakologische (Anwendung des Kanal-Blocker) oder gentechnische Ansätze in der Regel verwendet. Im letzteren Fall wird die Unterdrückung der Proteinexpression durch gezielte mRNA (Zuschlag) erreicht oder genomischer DNA mit globalen oder gewebespezifische9 löschen ein Exon Codierung eine Pore bilden Untereinheit eines Kanals (Knockout) bearbeiten. Die Verfügbarkeit eines Blockers mit ausreichender Spezifität für diese Kanäle beschränkt. Darüber hinaus der Knockdown Ansatz erfordert sorgfältige Kontrolle über seine Effektivität verwenden, z. B.., Western blot Analyse, und durch das Fehlen von spezifischen Antikörpern für die gezielte Kanal-Protein in vielen Fällen behindert wird. So ist die Verwendung von Knockout-Maus-Modellen nach wie vor als Goldstandard für eine solche Analyse betrachtet. Eine bevorzugte in Vitro Modell zur Untersuchung von MC-Funktionen ist der Anbau von PMCs, die isolierte ex Vivo als voll ausgereifte Population werden können (im Gegensatz zu differenzieren MCs in Vitro aus, zB., Knochenmarkzellen)10 . Im Vergleich zu dem Knochenmark abgeleitet MCs (BMMCs), die auch häufig verwendet werden, zu studieren, MC-Funktion in Vitro, die Stimulation der FcεRI und Beta-Hexosaminidase Release 8-fach und 100fach PMCs, bzw. erhöht. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von murinen PMCs, die es erlaubt, um zu erhalten, nach 2 Wochen der Kultivierung einer hohen Anzahl von reinen Bindegewebe MCs, ausreichend für die weitere Analyse geben.
Trotz der jüngsten Fortschritte in der Entwicklung und Anwendung von genetisch codierte Kalzium Indikatoren ist deren Nutzung noch durch Schwierigkeiten bei der Lieferung von Genen an Zielzellen, insbesondere in hoch spezialisierten Zellen wie primäre kultivierten MCs begrenzt. Darüber hinaus fehlt diese Gruppe von fluoreszierenden Indikatoren für [Ca2 +]ich Messungen noch ratiometrischen Farbstoffe mit einem hohen Dynamikumfang. Aus diesen Gründen ist die bevorzugte Methode für ratiometrischen [Ca2 +]ich Messung noch die Verwendung von fluoreszierenden Farbstoff “Fura-2”11.
Derzeit die am häufigsten verwendete Ansatz für die Bewertung von MC-Aktivierung und Degranulation ist die Messung der Aktivität der β-Hexosaminidase. Β-Hexosaminidase, eine allergische Mediator ist eine MC Modul Komponenten, die in einem konstanten Verhältnis von MCs-12zusammen mit Histamin freigegeben ist. Β-Hexosaminidase ist leicht und präzise durch die Reaktion mit einem speziellen Substrat messbar erzeugt eine messbare Menge eines Colorigenic Produkts, das in einer Mikrotestplatte kolorimetrischen Probe leicht nachweisbar ist. In diesem Artikel wird eine Anwendung dieser Technik für die Analyse von PMCs Degranulation in Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen berichtet.
Aggregation von der hohen Affinität plasmalemmal IgE-Rezeptor (FcɛRI) wird im MCs eine vielseitige intrazellulären Signalweg führt zu einer Freisetzung von sekretorischen Granulat Inhalt in den extrazellulären Raum aktiviert. Neben den spezifischen Antigen, können viele andere Reize aktivieren MCs um vielfältige immunmodulatorische Mediatoren wie Ergänzung Anaphylatoxins freizugeben (zB., C3a und C5a)13, Vasokonstriktor Peptid Endothelin 1 (ET1)14 , als auch zahlreiche kationischen Substanzen und Drogen pseudoallergische Reaktionen zu provozieren (zB., Icatibant)15 durch Bindung an MRGPRX216. Intrazelluläre Signalwege MRGPR-induzierte MCs Degranulation beteiligt sind schlecht im Vergleich zu FcɛRI-vermittelten intrazelluläre Signale gekennzeichnet; Diese Wege erst während der letzten paar Jahre17 nach der Rezeptor Identifikation16intensiv untersucht werden. Weitgehend, bleiben die Plasmamembran Ionenkanäle beteiligt Kalzium Eintrag gefolgt von MRGPRX2 Anregung verstanden werden. Daher der vorliegende Artikel konzentriert sich auch auf intrazellulären Calcium-Signalisierung und Degranulation der MCs mit MRGPR Agonisten stimuliert.
Protocol
Representative Results
Discussion
MC Modelle können erfolgreich zur Untersuchung MC Degranulation, Chemotaxis, Haftung, sowie intrazelluläre Signaltransduktion Signalwege MC Aktivierung beteiligt zu erhellen. Einige Forscher Verwendung menschlicher MCs-Modelle, wie verewigt Linien (LAD2 und HMC1) oder menschliche MCs aus Cord abgeleitet blood Vorläuferzellen (CD133 +) und Vorläuferzellen des peripheren Blutes (CD34 +). Andere bevorzugen Nagetier MC Modelle, wie z. B. verewigt (Ratte basophile Leukämie RBL – 2H 3 MC Linie) oder primäre kultiviert (M…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Julia Geminn für technische Hilfe bei der Vorbereitung der Mastzellen und Kultivierung zu bestätigen. Diese Arbeit wurde durch die transregionalen Sonderforschungsbereich (SFB-TR) 152 unterstützt.
Materials
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
Riferimenti
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Galli, S. J., et al. Mast cells as “tunable” effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
- Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
- Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
- Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
- Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
- Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
- Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
- Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
- Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
- Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
- Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
- Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).
