Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca2 +-beeldvorming en degranulatie vitrotests
Summary
Hier presenteren we een protocol om te isoleren en te cultiveren lymfkliertest peritoneale mestcellen. Ook beschrijven we twee protocollen voor hun functionele karakterisering: een fluorescerende beeldvorming van intracellulaire gratis Ca2 + concentratie en een degranulatie kwantitatieve analyse gebaseerd op colorimetrische kwantificering van de vrijgegeven β-hexosaminidase.
Abstract
Mastcellen (MCs), spelen als onderdeel van het immuunsysteem, een belangrijke rol bij de verdediging van de gastheer tegen diverse ziekteverwekkers en in de inleiding van de allergische reactie van het immuunsysteem. De activering van MCs via de cross-linking van oppervlak IgE bij hoge affiniteit IgE-receptor (FcεRI), maar ook via de stimulatie van verschillende andere receptoren gebonden, initieert de opkomst van de vrije intracellulaire Ca2 + niveau ([Ca2 +]ik) dat bevordert de vrijlating van inflammatoire en allergische bemiddelaars/mediators. De identificatie van moleculaire bestanddelen die betrokken zijn bij deze signaalroutes is van cruciaal belang voor het begrijpen van de verordening van MC functie. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de isolatie van lymfkliertest bindweefsel type MCs door peritoneale lavage en teelt van peritoneale MCs (PMCs). Culturen van MCs uit verschillende Muismodellen van de knock-out door deze methodologie vertegenwoordigen een nuttige benadering voor de identificatie van eiwitten die betrokken zijn in MC signalering trajecten. Bovendien, we tevens een protocol voor eencellige Fura-2 imaging zoals een belangrijke techniek voor de kwantificering van Ca2 + signalering in MCs. fluorescentie gebaseerde controle voor [Ca2 +]ik een betrouwbare is en veelgebruikte aanpak studie Ca2 + signalering gebeurtenissen, met inbegrip van winkel bediende calcium ingang, die van het grootste belang voor de activering van de MC is. Voor de analyse van MC degranulatie beschrijven we een β-hexosaminidase release assay. Het bedrag van de β-hexosaminidase vrijgegeven in het kweekmedium is beschouwd als een degranulatie marker voor alle drie verschillende secretoire deelverzamelingen beschreven in MCs. β-hexosaminidase kan gemakkelijk worden gekwantificeerd door haar reactie met een substraat van de colorigenic in een microtiterplaat plaat colorimetrische bepaling. Deze zeer reproduceerbaar techniek is kosteneffectief en vereist geen gespecialiseerde apparatuur. Over het geheel genomen het verstrekte protocol blijkt een hoge opbrengst weergeven voor MCs uiting van typische MC oppervlakte markeringen, typische morfologische en fenotypische kenmerken van MCs en demonstreren zeer reproduceerbaar reacties op secretagogues in Ca2 +– beeldvorming en degranulatie testen.
Introduction
MCs spelen een prominente rol tijdens aangeboren en verworven immuunrespons. Specifiek, MCs deelnemen aan het doden van ziekteverwekkers, zoals bacteriën en parasieten, en ook degraderen potentieel toxische endogene peptiden of componenten van de boosdoeners (voor recensie zie Galli et al. 20081). De fysiologische rol van MCs in aangeboren en adaptieve immuniteit is het onderwerp van een verhit debat. Daarom moeten de talrijke verschillen van de gegevens in de studies met verschillende Muismodellen van de MC-deficiënte systematische herbeoordeling van immunologische functies voor MCs buiten allergie2. Volwassen MCs zijn meestal gelokaliseerd in weefsels en organen zoals de huid, longen en darmen, en bevinden zich meestal alleen in kleine aantallen in het bloed. MCs hematopoietische precursoren, zoals MC progenitorcellen, ontlenen en hun differentiatie en rijping in de microenvironments van bijna alle gevacuoliseerd weefsels1te voltooien. Factor T-cell-derived Interleukine (IL) -3 promoot selectief de levensvatbaarheid, proliferatie en differentiatie van de bevolking van een pluripotente van muis MCs uit hun hematopoietische progenitorcellen3. Stamcel factor (SCF) wordt geproduceerd door structurele cellen in de weefsels en speelt een cruciale rol in de MC ontwikkeling, overleving, migratie en functie4. De eigenschappen van afzonderlijke MCs kunnen verschillen afhankelijk van hun vermogen om te synthetiseren en slaan verschillende proteasen of proteoglycans. Bij muizen, zijn de zogenaamde bindweefsel-type MCs mucosal MCs volgens hun anatomische lokalisatie, de morfologie en de inhoud van heparine en proteasen5onderscheiden.
In MCs, een stijging van gratis cytosolische Ca2 + ([Ca2 +]ik) is onmisbaar voor de degranulatie en productie van eicosanoiden, alsmede voor de synthese van cytokinen en activering van transcriptiefactoren in reactie op het antigeen en verschillende secretagogues6. Een belangrijk downstream doelwit van deze stimuli is phospholipase C, die ontstabiel phosphatidylinositol 4,5-difosfaat tot diacylglycerol (DAG) en inositol-1,4,5-trisphosphate. DAG geactiveerd proteïne kinase C en IP3 releases ionen van Ca2 + van het endoplasmatisch reticulum. Uitputting van deze winkels activeert Ca2 + toestroom via plasmamembraan Ca2 + kanalen, wat leidt tot het opslaan van bediende calcium ingang (SOCE). Dit proces wordt opgeroepen door de interactie van de Ca2 +-sensor, stromale interactie molecuul-1 (Stim1), in het endoplasmatisch reticulum met Orai17 , alsook door middel van de activering van voorbijgaande receptor potentiële canonieke (TRPC) kanaal eiwitten (voor recensie zie Freichel et al. 20148) in het plasma-membraan.
Om te studeren worden de fysiologische rol van deze kanalen, verschillende farmacologische (toepassing van kanaal-blokkers) of genetische benaderingen meestal gebruikt. In het laatste geval, onderdrukking van eiwit expressie wordt bereikt door zich te richten van mRNA (knockdown) of genomic DNA bewerken met globale of weefsel-specifieke9 schrapping van een exon codering een porie vormen subeenheid van een kanaal (knock-out). De beschikbaarheid van een blocker met voldoende specificiteit voor deze kanalen is beperkt. Daarnaast de vechtpartij aanpak vereist zorgvuldige controle van haar effectiviteit gebruikt, bijv., westelijke analyse van de vlek, en wordt gehinderd door het ontbreken van specifieke antilichamen voor de gerichte kanaal proteïne in veel gevallen. Dus, het gebruik van knock-out Muismodellen wordt nog steeds beschouwd als de gouden standaard voor een dergelijke analyse. Een voorkeur in vitro model voor het onderzoek van MC functies is de teelt van PMCs die geïsoleerde ex vivo als een volwassen populatie worden kunnen (in tegenstelling tot differentiëren MCs in vitro van, bijv., beenmergcellen)10 . In vergelijking met het beenmerg afgeleid MCs (BMMCs), die ook gebruikt zijn bij het bestuderen van MC functie in vitro, de stimulatie van FcεRI en bèta-hexosaminidase is versie verhoogd, 8-fold en 100-fold in PMCs, respectievelijk. In dit artikel beschrijven we een methode van isolatie en de teelt van lymfkliertest PMCs, die het mogelijk maakt om te verkrijgen na 2 weken voor het kweken van een groot aantal zuivere bindweefsel Typ MCs, voldoende voor verdere analyse.
Ondanks de recente vooruitgang in de ontwikkeling en toepassing van genetisch gecodeerde calcium indicatoren het gebruik ervan is nog steeds beperkt door moeilijkheden bij de levering van genen aan doelcellen, specifiek, in zeer gespecialiseerde cellen zoals primaire gekweekte MCs. Bovendien ontbreekt deze groep van fluorescerende indicatoren voor [Ca2 +]ik metingen nog steeds ratiometric kleurstoffen met een hoog dynamisch bereik. Om deze redenen is de aanbevolen methode voor meting van ratiometric [Ca2 +]ik nog steeds het gebruik van de fluorescente kleurstof “Fura-2”11.
Op dit moment de meest gebruikte aanpak voor de evaluatie van de activering van de MC en degranulatie is het meten van β-hexosaminidase-activiteiten. Β-hexosaminidase, een allergische bemiddelaar, is een van de onderdelen van de MC-submodule die mede vrijgegeven met histamine is in constante verhouding van MCs12. Β-hexosaminidase kan gemakkelijk en nauwkeurig gemeten worden door de reactie met een specifieke substraat, die produceert een meetbare hoeveelheid een colorigenic product dat gemakkelijk in een microplate colorimetrische bepaling aantoonbaar. In dit artikel, is een toepassing van deze techniek voor de analyse van PMCs degranulatie in reactie op een verscheidenheid van stimuli gemeld.
Samenvoeging van de hoge-affiniteit plasmalemmal IgE-receptor (FcɛRI) wordt geactiveerd in MCs een veelzijdige intracellulaire signalering weg, wat leidt tot een vrijval van secretoire submodule inhoud in de omliggende extracellulaire ruimte. Naast het specifieke antigeen, vele andere stimuli MCs om los van een divers scala aan immunomodulerende bemiddelaars, zoals aanvulling anafylatoxines kunnen activeren (bv., C3a en C5a)13, de vasoconstrictor peptide endothelin 1 (ET1)14 , als ook talrijke kationogene stoffen en drugs veroorzaken pseudoallergic Reacties (bv., icatibant)15 door binding aan MRGPRX216. Intracellulaire signaalroutes die betrokken zijn bij MRGPR-geïnduceerde MCs degranulatie worden slecht gekenmerkt in vergelijking met FcɛRI-gemedieerde intracellulaire signalering; deze trajecten alleen gestart worden intensief bestudeerd tijdens de laatste paar jaar17 na de receptor identificatie16. Grotendeels, blijven het plasmamembraan ionenkanalen die betrokken zijn bij de ingang van calcium gevolgd door stimulatie van de MRGPRX2 om te worden begrepen. Dus, dit artikel ook focust op intracellulair calcium signalering en degranulatie van MCs gestimuleerd met MRGPR-agonisten.
Protocol
Representative Results
Discussion
MC modellen kunnen met succes worden gebruikt om te studeren MC degranulatie chemotaxis, adhesie, alsmede over de intracellulaire signaaltransductie signaalroutes betrokken bij MC activering verhelderen. Sommige onderzoekers gebruik menselijke MCs modellen, zoals vereeuwigd lijnen (LAD2 en HMC1) of menselijke MCs afgeleid van koord bloed voorlopercellen (CD133 +) en perifeer bloed voorlopercellen (CD34 +). Anderen verkiezen knaagdier MC modellen, zoals vereeuwigd (rat basofiele leukemie RBL – 2H 3 MC lijn) of primaire ge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs wil erkennen Julia Geminn voor technische bijstand in de mestcel voorbereiding en kweken. Dit werk werd gesteund door de transregionale Collaborative Research Centre (TR-SFB) 152.
Materials
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
Riferimenti
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Galli, S. J., et al. Mast cells as “tunable” effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
- Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
- Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
- Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
- Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
- Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
- Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
- Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
- Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
- Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
- Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
- Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).
