Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca2 +-imagens e ensaios de degranulação
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar os mastócitos peritoneais murino. Também descrevemos dois protocolos para a sua caracterização funcional: uma imagem fluorescente de enciclopédia Ca2 + concentração intracelular e um ensaio de degranulação baseado na quantificação colorimétrica de β-hexosaminidase a liberado.
Abstract
Mastócitos (MCs), como parte do sistema imunológico, um papel fundamental na defesa do hospedeiro contra vários patógenos e no início da resposta imune alérgica. A ativação de MCs através do cross-linking de superfície IgE ligado ao receptor de IgE de alta afinidade (FcεRI), bem como através da estimulação de vários outros receptores, inicia a ascensão do livre intracelular Ca2 + nível ([Ca2 +]eu) que promove a liberação de mediadores inflamatórios e alérgicos. A identificação dos constituintes moleculares envolvidos nessas vias de sinalização é crucial para a compreensão da regulação da função MC. Neste artigo, descrevemos um protocolo para o isolamento do tipo murino tecido conjuntivo MCs pela lavagem peritoneal e cultivo de MCs peritoneais (EPM). Culturas de MCs de vários modelos de rato nocaute por esta metodologia representam uma abordagem útil para a identificação das proteínas envolvidas na MC vias de sinalização. Além disso, podemos também descrever um protocolo para unicelulares Fura-2 de imagens como uma técnica importante para a quantificação de Ca2 + sinalização no MCs. baseada em fluorescência monitoramento de [Ca2 +] é um confiável e comumente usado abordagem estudo de Ca2 + sinalização de eventos, incluindo a entrada de cálcio operada a loja, que é de extrema importância para a ativação do MC. Para a análise de MC degranulação, descrevemos um ensaio de liberação de β-hexosaminidase. A quantidade de β-hexosaminidase lançado no meio de cultura é considerada como um marcador de degranulação para todos os três diferentes secretoras subconjuntos descrito no MCs. β-hexosaminidase facilmente pode ser quantificado pela sua reação com um substrato de colorigenic em um ensaio colorimetric da placa da microplaca. Esta técnica altamente reprodutível é cost-effective e exige nenhum equipamento especializado. No geral, o protocolo fornecido demonstra um alto rendimento de MCs expressando marcadores de superfície típicas MC, exibindo características fenotípicas e morfológicas típicas da MCs e demonstrando respostas altamente reprodutíveis para secretagogues de Ca2 +– ensaios de imagem e degranulação.
Introduction
MCs desempenham um papel proeminente durante respostas de imune inatas e adquiridas. Especificamente, MCs participarem na morte de patógenos, como bactérias e parasitas e também degradam peptídeos endógenos potencialmente tóxicos ou componentes de venenos (para revisão, consulte Galli et al . 20081). O papel fisiológico de MCs na inata e imunidade adaptativa é objecto de debate acalorado. Portanto, as inúmeras discrepâncias de dados nos estudos realizados com diferentes modelos de rato MC-deficientes exigem uma reavaliação sistemática de funções imunológicas de MCs além de alergia2. MCs maduros são localizadas principalmente em tecidos e órgãos como a pele, pulmão e intestino e normalmente são encontrados apenas em pequenas quantidades no sangue. MCs derivam de precursores hematopoiéticos, como progenitores de MC e completar a sua diferenciação e maturação no microambiente que de quase todos os tecidos vascularizados1. Fator derivado de T-células interleucina (IL) -3 promove seletivamente a viabilidade, proliferação e diferenciação de uma população de pluripotentes de rato MCs de seus progenitores hematopoiéticos3. Fator de célula-tronco (SCF) é produzido por células estruturais nos tecidos e desempenha um papel crucial no desenvolvimento da MC, sobrevivência, migração e função4. As propriedades de MCs individuais podem variar dependendo de sua capacidade de sintetizar e armazenar várias proteases ou proteoglicanos. Nos ratos, os tipo de tecido conjuntivo chamados MCs são distintos dos MCs da mucosa de acordo com sua localização anatômica, morfologia e conteúdo de heparina e proteases5.
No MCs, um aumento de livre citosólico Ca2 + ([Ca2 +]eu) é indispensável para a degranulação e a produção de eicosanoides, bem como para a síntese de citocinas e a ativação de fatores de transcrição em resposta ao antígeno e vários secretagogues6. Um grande alvo a jusante estes estímulos é a fosfolipase C que hidrolisa fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato diacilglicerol (DAG) e inositol 1, 4,5-triphosphate. DAG ativa a proteína quinase C e IP3 libera íons de Ca2 + do retículo endoplasmático. Esgotamento destas lojas ativa Ca2 + fluxo através da membrana plasmática Ca2 + canais, levando para armazenar a entrada de cálcio operados (SOCE). Este processo é evocado através da interação do Ca2 +-sensor, estromais interação molécula-1 (Stim1), no retículo endoplasmático com Orai17 , bem como através da ativação de canal potencial de (TRPC) canônico transitória do receptor proteínas (para revisão, ver Freichel et al . 20148) na membrana plasmática.
Para estudar o papel fisiológico desses canais, vários farmacológicos (aplicação de bloqueadores dos canais) ou abordagens genéticas são normalmente usadas. Neste último caso, supressão da expressão da proteína é alcançado pela segmentação do mRNA (“knockdown”) ou edição de DNA genômico com exclusão global ou tecido-específica9 de um exon codificação um poro formando a subunidade de um canal (nocaute). A disponibilidade de um bloqueador com especificidade suficiente para estes canais é limitada. Além disso, a abordagem “knockdown” requer controle cuidadoso de sua efetividade, usando, por exemplo., Western blot análise e é dificultado pela indisponibilidade de anticorpos específicos para a proteína do alvo do canal em muitos casos. Assim, o uso de modelos de rato nocaute ainda é considerado como o padrão ouro para tal análise. Um modelo preferencial em vitro para a investigação das funções do MC é o cultivo da EPM que pode ser isolada ex vivo como uma população totalmente madura (em oposição a diferenciar MCs em vitro de, por exemplo., células da medula óssea)10 . Em comparação com MCs derivada de medula óssea (BMMCs), que também são comumente usados para estudar MC função em vitro, a estimulação de FcεRI e beta-hexosaminidase lançamento é aumento 8-fold e 100-fold na EPM, respectivamente. Neste artigo, descrevemos um método de isolamento e cultivo de murino PMCs, que permite para obter após 2 semanas de cultivo um elevado número de puro tecido conjuntivo digite MCs, suficientes para uma análise mais aprofundada.
Apesar dos recentes progressos no desenvolvimento e aplicação de indicadores de cálcio geneticamente codificado, seu uso é ainda limitado por dificuldades na entrega de genes nas células-alvo, especificamente, em células altamente especializados como principais culturas MCs. Além disso, este grupo de indicadores fluorescentes para [Ca2 +]eu medições ainda carece de corantes ratiometric com uma alta gama dinâmica. Por estas razões, o método preferido para a medição ratiometric [Ca2 +]eu ainda é o uso do corante fluorescente “Fura-2”11.
Atualmente, os mais usados abordagem para a avaliação da ativação de MC e degranulação é a medição da atividade de β-hexosaminidase. Β-hexosaminidase, um mediador alérgico, é um dos componentes do grânulo de MC que é co lançado com histamina em proporção constante de MCs12. Β-hexosaminidase pode ser prontamente e com precisão medido através de sua reação com um substrato específico, que produz uma quantidade mensurável de um produto de colorigenic que é facilmente detectável em um ensaio colorimétrico de microplacas. Neste artigo, é relatada uma aplicação desta técnica de análise de degranulação PMCs em resposta a uma variedade de estímulos.
Agregação de receptor de IgE plasmalemmal de alta afinidade (FcɛRI) ativa no MCs versátil via de sinalização intracelular, levando a uma liberação do conteúdo do grânulo secretor no espaço extracelular circundante. O antígeno específico, além de muitos outros estímulos podem ativar MCs para liberar um diversificado leque de mediadores de imunomoduladores, como anafilatoxinas do complemento (ex., C3a e C5a)13, a vasoconstritor peptídeo endotelina 1 (ET1)14 , como bem como numerosas substâncias catiônicas e drogas provocando reações pseudoallergic (EG., Icatibanto)15 por ligação a MRGPRX216. Vias de sinalização intracelulares envolvido na degranulação induzida por MRGPR MCs caracterizam-se mal em comparação com FcɛRI mediada por sinalização intracelular; essas vias só começaram a ser estudada intensamente durante os últimos poucos anos17 após o receptor identificação16. Em grande parte, os canais iônicos de membrana plasmática envolvidos na entrada de cálcio, seguida de estimulação MRGPRX2 permanecem para ser compreendido. Portanto, o presente artigo centra-se na sinalização intracelular do cálcio e degranulação de MCs estimulada com agonistas MRGPR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelos MC podem ser usados com sucesso para estudar MC degranulação, quimiotaxia, adesão, bem como para elucidar intracelular vias de transdução sinalização envolvidas na ativação de MC. Alguns pesquisadores uso modelos humanos MCs, tais como linhas imortalizadas (LAD2 e HMC1) ou MCs humanas derivados da medula sangue células progenitoras (CD133 +) e células progenitoras de sangue periférico (CD34 +). Outros preferem roedores modelos MC, tais como imortalizados (leucemia basophilic do rato RBL – 2H 3 MC linh…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de reconhecer a Julia Geminn para obter assistência técnica na preparação de mastócitos e cultivo. Este trabalho foi apoiado pela transregionais o centro de investigação colaborativa (TR-SFB) 152.
Materials
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
Riferimenti
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