Yalıtım Karın zarını kaynaklı Mast hücreleri ve onların fonksiyonel karakterizasyonu ile Ca2 +-görüntüleme ve Degranulation deneyleri
Summary
Burada, izole ve fare peritoneal mast hücreleri yetiştirmek için bir protokol mevcut. Biz de onların fonksiyonel karakterizasyonu için iki protokol tarif: hücre içi ücretsiz Ca2 + toplama ve degranulation tahlil floresan bir görüntüleme dayalı yayımlanan β-hexosaminidase Renkölçer miktar üzerinde.
Abstract
Mast hücreleri (MCs), bağışıklık sisteminin bir parçası olarak ana bilgisayar çeşitli patojenlere karşı savunmak ve alerjik bağışıklık yanıtı başlatılması önemli bir rol oynar. MCs aktivasyonu IgE bağlı yüksek afinite IgE reseptör (FcεRI) yanı sıra çeşitli diğer reseptörleri uyarılması yoluyla yüzey cross-linking üzerinden ücretsiz intrasellüler Ca2 + düzeyi yükselişi başlatır ([Ca2 +]ben) Bu inflamatuar ve alerjik arabulucu yayın teşvik etmektedir. Moleküler bileşenlerin bu sinyal yollar dahil tanımlaması MC işlevi Yönetmeliği anlamak için önemlidir. Bu makalede, biz fare bag doku türü MCs peritoneal lavaj tarafından yalıtım ve periton MCs (PMCs) tarımı için bir iletişim kuralı tanımlamak. MCs kültürleri Bu metodoloji tarafından çeşitli nakavt fare modellerinden proteinler yolları sinyal MC dahil tanımlaması için faydalı bir yaklaşım temsil eder. Buna ek olarak, ayrıca MCs. floresans tabanlı izleme [Ca2 +]ben içinde sinyal Ca2 + miktar için önemli bir teknik bir güvenilir olduğu gibi tek hücre Fura-2 görüntüleme için bir protokol açıklar ve sık kullanılan yaklaşım olaylar, MC harekete geçirmek için son derece önem taşıyor kalsiyum deposu ile çalışan giriş de dahil olmak üzere sinyal Ca2 + çalışma. MC degranulation analiz için β-hexosaminidase yayın tahlil açıklar. Degranulation kalem MCs. β-hexosaminidase içinde açıklanan tüm üç farklı salgı alt kümeleri için kolayca onun reaksiyonu ile bir colorigenic substrat tarafından sayısal olarak β-hexosaminidase kültür orta serbest miktarı kabul edilir bir microtiter plaka Renkölçer tahlil. Bu son derece tekrarlanabilir teknik düşük maliyetli ve hiçbir özel ekipman gerektirir. Genel olarak, yüksek bir verim sağlanan iletişim kuralı gösterir tipik MC yüzey işaretleyicileri ifade MCs MCs tipik morfolojik ve fenotipik özellikleri görüntülemek ve secretagogues Ca2 +– son derece tekrarlanabilir yanıt gösteren görüntüleme ve degranulation deneyleri.
Introduction
MCs doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık yanıtı sırasında önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle, MCs patojenler, bakteri ve parazit gibi öldürülmesi katılmak ve aynı zamanda potansiyel olarak toksik endojen peptidler veya zehirlerini (için gözden geçirme bakın Galli ve ark. 20081) bileşenlerinin bozulmasına yol açar. Doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık MCs fizyolojik rolü ısıtmalı tartışma konusudur. Bu nedenle, çok sayıda veri tutarsızlıkları farklı MC-eksik fare modelleri ile gerçekleştirilen çalışmalarda Anti2ötesinde immünolojik fonksiyonların MCs sistematik bir yeniden değerlendirme gerektirir. Olgun MCs çoğunlukla doku ve organları deri, akciğer ve bağırsak gibi içinde lokalizedir ve genellikle küçük rakamlarla sadece kan bulunur. MCs hematopoetik öncüleri, MC ataları gibi türetilir ve onların farklılaşma ve hemen hemen tüm bozukluklarına dokular1microenvironments içinde olgunlaşma tamamlayın. T-hücre kaynaklı faktör interlökin (IL) -3–dan onların hematopoetik ataları3seçmeli olarak canlılığı, yayılmasını önleme ve fare MCs pluripotent nüfusu farklılaşma teşvik etmektedir. Kök hücre faktörü (SCF) dokularda yapısal hücreleri tarafından üretilen ve MC geliştirme, hayatta kalma, göç ve işlev4önemli bir rol oynar. Bireysel MCs özelliklerini sentez ve çeşitli proteaz veya proteoglikanlar depolamak için yeteneklerini bağlı olarak farklı olabilir. Farelerde, sözde Bag Doku tipi MCs anatomik lokalizasyon, Morfoloji ve heparin ve proteaz5içeriğine göre mukozal MCs dan ayırt edilirler.
MCs, artış ücretsiz sitozolik Ca2 + ([Ca2 +]ben) degranulation ve üretim eikozanoidler, yanı sıra sitokinler sentezi ve transkripsiyon faktörleri yanıt antijen olarak aktivasyonu için vazgeçilmez ve çeşitli secretagogues6. Bir büyük aşağı akım bu uyaranlara phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate diacylglycerol (DAG) ve inositol 1,4,5-trisphosphate hidrolize Fosfolifaz C, hedeftir. Protein kinaz C DAG etkinleştirir ve IP3 Ca2 + endoplazmik retikulum üzerinden iyonları serbest bırakır. Bu mağazaların tükenmesi Ca2 + akını işletilen kalsiyum giriş (SOCE) depolamak için önde gelen plazma zarı Ca2 + kanal, üzerinden etkinleştirir. Bu işlem, Ca2 +etkileşim yoluyla uyarılmış-sensör, stromal etkileşim molekülü-1 (Stim1), Orai17 ile yanı sıra geçici reseptör potansiyel kurallı (TRPC) Kanal aktivasyonu aracılığıyla endoplazmik retikulum ‘ proteinler (için gözden geçirme bkz: Freichel vd. 20148) plazma zarı içinde.
İncelemek için bu kanal, çeşitli farmakolojik fizyolojik rolü (kanal blokerleri uygulanması) veya genetik yaklaşımlar genellikle kullanılır. İkinci durumda, protein ifade bastırılması mRNA (devirme) hedef alarak elde edilir veya genomik DNA düzenleme bir kanal (nakavt) alt birimi oluşturan bir gözenek kodlama bir exon global ya da doku-özel9 silme işlemine. Availability-in a kütük parçası bu kanallar için yeterli özgüllük ile sınırlıdır. Buna ek olarak, devirme yaklaşım dikkatli kullanarak, Örneğinkendi etkinliğini kontrolünü gerektirir., Batı analiz leke ve birçok durumda hedeflenen kanal protein için özel antikorlar kullanılamamasıdır tarafından engel oluyor. Böylece, nakavt fare modelleri kullanımını hala böyle analiz için altın standart olarak kabul edilir. Bir tercih edilen vitro MC fonksiyonlar soruşturma için tam olgun bir nüfus olarak izole ex vivo olabilir PMCs ekimi modeldir ( e.g–dan, MCs vitro ayırt karşı., kemik iliği hücreleri)10 . MC işlevi vitro, FcεRI ve beta-hexosaminidase uyarılması çalışmaya da sık kullanılan kemik iliği türetilmiş MCs ile karşılaştırıldığında (BMMCs), serbest 8-fold ve 100-fold PMCs, sırasıyla arttırılır. Bu makalede, saf bağ dokusu yüksek sayıda kültür 2 hafta MCs, daha fazla çözümleme için yeterli yazdıktan sonra elde etmek için izin veren fare PMCs, tarımı ve yalıtım yöntemi açıklanmaktadır.
Geliştirme ve uygulama genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerin son ilerlemeye rağmen bunların kullanım hala hedef hücrelere gen teslim zorluklar tarafından özellikle, son derece uzmanlaşmış hücreleri gibi birincil kültürlü MCs sınırlıdır. Buna ek olarak, bu grup için [Ca2 +] ölçümleriben floresan göstergelerin hala ratiometric boyalar ile yüksek dinamik Aralık yoksun. Bu nedenlerden dolayıben ratiometric [Ca2 +] ölçüm için tercih edilen yöntem hala floresan boya “Fura-2”11kullanmaktır.
Şu anda, en sık yaklaşım MC harekete geçirmek değerlendirilmesi için kullanılan. ve degranulation β-hexosaminidase aktivitesinin ölçümdür. Β-hexosaminidase, Alerjik bir arabulucu sabit oranda MCs12histamin ile birlikte yayımlanan MC granül bileşenlerden biridir. Β-hexosaminidase Mikroplaka Renkölçer assay olarak kolayca algılanabilir bir colorigenic ürün ölçülebilir bir miktar üretir belirli bir yüzey ile onun reaksiyonu ile kolayca ve doğru bir şekilde ölçülebilir. Bu makalede, bir uygulama PMCs degranulation çeşitli uyaranlara yanıt olarak çözümlenmesi için bu tekniğin bildirilmektedir.
Toplama yüksek benzeşme plasmalemmal IgE reseptör (FcɛRI) bir yayın salgı granül içerik çevreleyen ekstrasellüler alanda önde gelen bir çok yönlü hücre içi sinyal yolu, MCs içinde etkinleştirir. Spesifik antijen ek olarak, birçok diğer bir çekim gücü-ebilmek harekete geçirmek immunomodulatory arabulucu, tamamlayıcı anaphylatoxins gibi çeşitli bir dizi serbest bırakmak için MCs (Örn., C3a ve C5a)13, vasoconstrictor peptid endotelin 1 (ET1)14 , o kadar çok sayıda katyonik maddeler ve pseudoallergic reaksiyonlar provoke uyuşturucu olarak (Örn., icatibant)15 MRGPRX216bağlama yaparak. Hücre içi sinyal yolları MRGPR kaynaklı MCs degranulation ilgili kötü FcɛRI-aracılı hücre içi sinyal ile karşılaştırıldığında karakterizedir; Bu yollar sadece son birkaç yıl17 sırasında reseptör kimlik16sonra yoğun bir şekilde incelenecektir başladı. Büyük ölçüde, plazma zarı iyon kanalları MRGPRX2 stimülasyon tarafından takip kalsiyum giriş dahil anlaşılması kalır. Bu nedenle, mevcut makale da hücre içi kalsiyum sinyal üzerinde duruluyor ve MCs degranulation MRGPR agonistleri ile uyarılmış.
Protocol
Representative Results
Discussion
MC modelleri, MC degranulation, kemotaksis, adezyon, de hücre içi sinyal iletim yollarının MC harekete geçirmek içinde yer aydınlatmak için çalışmaya başarıyla kullanılabilir. Kullanım insan MCs modelleri, ölümsüzleştirdi hatları (LAD2 ve HMC1) veya insan MCs gibi türetilen kablosunu ve bazı araştırmacılar kan progenitör hücreler (CD133 +) ve periferik kan progenitör hücreler (CD34 +). Diğerleri kemirgen MC modelleri, (sıçan bazofilik lösemi RBL – 2 H 3 MC satır) gibi ölümsüzleştiril…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Julia Geminn mast hücresi hazırlık ve kültür teknik yardım almak için kabul etmek istiyorum. Bu eser Transregional ortak araştırma merkezi tarafından (TR-SFB) 152 desteklenmiştir.
Materials
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
Riferimenti
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Galli, S. J., et al. Mast cells as “tunable” effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
- Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
- Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
- Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
- Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
- Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
- Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
- Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
- Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
- Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
- Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
- Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).
