بيرفوسابل شبكة الأوعية الدموية مع نموذج أنسجة في جهاز موائع جزيئية
Summary
البروتوكول يصف كيفية مهندس شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل في كروي. هو استنباط المكروية المحيطة كروي للحث على الأوعية والاتصال كروي ميكروتشانيلس في جهاز موائع جزيئية. الأسلوب يسمح نضح كروي، وأسلوب الذي طال انتظاره في الثقافات ثلاثي الأبعاد.
Abstract
كروي (إجمالي متعددة الخلايا) يعتبر نموذجا جيدا للأنسجة الحية في جسم الإنسان. وعلى الرغم من التقدم الكبير في الثقافات كروي، تظل شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل في الماغنيسيوم تحديا حاسما للثقافة الطويلة الأجل اللازمة لصيانة وتطوير وظائفها، مثل التعبيرات البروتين و morphogenesis. ويقدم البروتوكول بطريقة جديدة لدمج شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل داخل كروي في جهاز موائع جزيئية. للحث على شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل في كروي، تسترشد براعم الأوعية متصلة ميكروتشانيلس إلى كروي باستخدام عوامل الأوعية من الليفية الرئة البشرية المستزرعة في كروي. براعم الأوعية بلغ كروي، اندمجت مع خلايا البطانية مثقف شارك في كروي، وشكلت شبكة الأوعية الدموية مستمرة. ويمكن أن نتخلل شبكة الأوعية الدموية الداخلية كروي دون أي تسرب. يمكن استخدام شبكة الأوعية الدموية شيدت كذلك كطريق للإمداد بالمواد المغذية، وإزالة النفايات، ومحاكاة دوران الدم في الجسم الحي. الأسلوب الذي يوفر منصة جديدة في ثقافة كروي نحو خلاصة أفضل من الأنسجة الحية.
Introduction
التحول من ثقافة (ثنائي الأبعاد) أحادي الطبقة إلى ثقافة ثلاثي الأبعاد هو بدافع الحاجة إلى العمل مع نماذج الثقافة التي تحاكي مهام الخلوية الحية الأنسجة1،،من23. ركائز بلاستيكية مسطحة والصلب يشيع استخدامها في خلية ثقافة لا يشبه معظم بيئات خارج الخلية في جسم الإنسان. وفي الواقع، تبين العديد من الدراسات أن هندسة الأنسجة على حدة إعادة إنشاء ثقافة ثلاثي الأبعاد والرموز الميكانيكية والكيميائية الحيوية والاتصالات خلية خلية، التي لم تحترم في الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد4، 5،6،،من78.
الكلية متعددة الخلايا أو كروي، واحد من التقنيات الواعدة لتحقيق هذه الثقافة ثلاثي الأبعاد9،10. خلايا تفرز المصفوفة خارج الخلية (ECM)، ويمكن أن تتفاعل مع الآخرين في كروي. على الرغم من أن بعض الهندسة الحيوية الأخرى النهج11،12،،من1314، مثل خلية التراص، بنجاح إجراء نسخ متماثل تعقيد المكانية للجسم البشري، وهذه النهج فقط اثنين أو ثلاثة أنواع الخلايا لسهولة التحليل والتركيز على وظيفة واحدة فقط من الأجهزة المستهدفة. على النقيض من ذلك، يتعرض لبيئات ثقافة مختلفة اعتماداً على مواقعها في كروي بسبب العرض غير متجانسة من المواد المغذية والأكسجين، وباراكريني و autocrine إشارات الجزيئات في كروي الخلايا في الماغنيسيوم. هذه الميزة من الماغنيسيوم يحاكي جزئيا في فيفو شرط الثقافة وتمكين الخلايا في الماغنيسيوم لإنشاء أنسجة أكثر تعقيداً بكثير، وتنظيم هيكل في المختبر من تلك المزروعة في التراص الأنسجة9، 15 , 16-لاحظ أن وظيفة الخلايا في كروي ليست موحدة بسبب البيئة غير متجانسة في كروي إذا كروي يتكون من نوع واحد من الخلايا،. في السنوات القليلة الماضية، يسمح الثقافات كروي الخلايا الجذعية pluripotent الخلايا الجذعية الجنينية (بتوليدا)، التي يسببها (إيبسكس) أو الخلايا الجذعية المقيم في الأنسجة تقليد في فيفو متواليات الإنمائية وإعادة إنشاء أجهزة مصغرة مثل الدماغ17، الكبد18والكلى19،20.
وعلى الرغم من التقدم الكبير في تقنيات ثقافة كروي، استزراع الماغنيسيوم كبيرة لفترة طويلة لا يزال يمثل مشكلة. في نسيج ثلاثي الأبعاد، تحتاج الخلايا يكون مقره داخل 150-200 ميكرون من الأوعية الدموية بسبب العرض المحدود من الأوكسجين والمواد المغذية21. شبكات الأوعية الدموية داخل كروي ضرورية لإيجاز تبادل المواد بين الدم والأنسجة في الجسم الحي. ولتحقيق ذلك، شارك مثقف خلايا بطانية مع هدف خلايا22،،من2324 المجموعات الأخرى أو الناجمين عن التفريق بين الخلايا pluripotent في CD31-إيجابية الخلايا20. ومع ذلك، لا تملك هياكل شبيهة بسفينة المبلغ عنها نهايات مفتوحة لومينا إمدادات الأوكسجين والمواد المغذية إلى مركز كروي. لتقليد دور الأوعية الدموية لتغذية الخلايا في ثقافة ثلاثي الأبعاد، يجب تطوير شبكة الأوعية الدموية مفتوحة وبيرفوسابل في كروي.
وخلال السنوات القليلة الماضية، ذكرت بعض المجموعات البحثية في ميدان ميكرونجينيرينج أساليب بناء شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل، تشكلت عفويا في جهاز موائع جزيئية باستخدام عوامل الأوعية من الخلايا كوكولتوريد تنتجها الخلايا الليفية25 ،26. هذه الشبكات والأوعية الدموية مورفولوجيا مماثلة لنظرائهم في فيفو ويمكن تشكيلها بالعوامل البيئية، وجعلها مناسبة لمحاكاة وظائف الأوعية الدموية في ثقافة كروي. والغرض من هذا البروتوكول بناء شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل في كروي استخدام منصة موائع جزيئية27. يتم تعديل الجهاز موائع جزيئية من الجهاز تم الإبلاغ عنها سابقا25 حيث يمكن إدراجها كروي. طريق توجيه إفراز الأوعية من الخلايا تنتجها الخلايا الليفية في كروي إلى خلايا بطانية في ميكروتشانيلس، براعم من ميكروتشانيلس أناستوموسيد مع كروي الأوعية وشكلت شبكة الأوعية الدموية بيرفوسابل. هذا الأسلوب يسمح تسليم مباشر لمجموعة واسعة من المواد، مثل الجزيئات الفلورسنت والخرز مقياس ميكرومتر في المناطق الداخلية من كروي، الذي يوفر الإطار لثقافة الأنسجة الطويلة الأمد مع شبكات الأوعية الدموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتظهر التقارير السابقة أن تفرز هلفس مزيج من عدة عوامل الأوعية، مثل أنجيوبويتين-1، أنجيوجينين، وعامل النمو تتمثل، تحويل عامل النمو-α وعامل نخر الورم وبعض المصفوفة خارج الخلية البروتينات29، 30. يعتمد هذا التحليل على إفراز الأوعية من هلفس في كروي كوكولتوري، وه…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها كريست JST (رقم المنحة JPMJCR14W4)، المجتمع لتعزيز للعلوم (JSPS) كاكينهي (رقم المنحة 25600060، 16386 ك 16)، “مركز برنامج الابتكار” من يأمرون و JST، “ركز المشروع” على “تطوير التكنولوجيا التقييم الرئيسية” من اليابان وكالة التنمية، AMED، مؤسسة ميزوهو للنهوض بالعلوم والبحوث الطبية. وأيد ميكروفابريكيشن “مركز تكنولوجيا النانو جامعة كيوتو”.
Materials
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
Riferimenti
- Abbott, A. Cell culture: Biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions – The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D., Yarmush, M. L. . Annual Review of Biomedical Engineering. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
