Un'analisi di citometria-basata di flusso per identificare i composti che interrompono il grippaggio del Ligand di Chemokine CXC fluorescente etichettati 12 al recettore di chemochine CXC 4
Summary
Un flusso di analisi basate su cytometry cellulare obbligatoria è descritto che è utilizzato principalmente come uno strumento di screening per identificare i composti che inibiscono il legame di un ligando di chemochine CXC fluorescente contrassegnato 12 (CXCL12) al recettore di chemochine CXC 4 (CXCR4).
Abstract
Targeting farmacologica dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è di grande importanza per la salute umana, come segnalazione disfunzionale GPCR-mediated contribuisce alla progressione di molte malattie. La coppia di ligando/recettore ligando di chemochine CXC 12 (CXCL12) / recettore delle chemochine CXC 4 (CXCR4) ha sollevato interesse clinico significativo, per esempio come un potenziale bersaglio per il trattamento di cancro e di malattie infiammatorie. Piccole molecole come pure gli anticorpi terapeutici specificamente destinate a CXCR4 e inibiscono la funzione del recettore sono pertanto considerati da preziosi strumenti farmacologici. Qui, un flusso cytometry cellulare test che permette l’identificazione di composti (ad esempio, piccole molecole) che abrogare CXCL12 associazione di CXCR4, è descritto. Essenzialmente, il dosaggio si basa sulla competizione per il recettore vincolante tra un importo fisso di CXCL12 fluorescente identificati, l’agonista di chemokine naturale per CXCR4 e composti senza etichetta. Quindi, in questo dosaggio è evitato l’uso indesiderabile di sonda marcata radioattivamente. Inoltre, le cellule viventi sono utilizzate come fonte di ricevitore (CXCR4) invece di preparazioni della membrana delle cellule. Questo consente il facile adattamento del dosaggio per un formato del piatto, che aumenta la velocità effettiva. Questo test ha dimostrato di essere un’analisi di scoperta del prezioso farmaco generico per identificare composti CXCR4-targeting. Il protocollo probabilmente può essere adattato ad altri GPCR, almeno se fluorescente contrassegnati ligandi sono disponibili o possono essere generati. Conoscenza preventiva riguardante le vie di segnalazione intracellulare che sono indotte all’attivazione di questi GPCR, non è necessario.
Introduction
I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono proteine di superficie delle cellule che possono essere attivati da ligandi extracellulari (ad es., peptidi, ormoni proteici, ammine), quindi molti fisiologici e di sviluppo che regolano i processi1. Quando un agonista occupa la tasca di associazione GPCR, il cambiamento conformazionale indotto nella proteina recettore promuove il legame di proteine intracellulari associata al recettore G eterotrimeriche, composto da Gα– PIL e subunitàβγ G. Il successivo scambio di GTP per PIL sui risultati di subunitàα G nella dissociazione delle subunità G proteine (Gα-GTP e Gβγ) che, a sua volta, ulteriormente avvierà a valle di segnalazione vie2,3. Quando il Gα-GTP diventa idrolizzato, ri-associazione il Gα– PIL e subunitàβγ G convertirà la proteina di G nel suo riposo di3,di stato4. Diversi tipi di proteine G esistano (Gs, G/ o, Gq, G12/13), che sono classificati basato su somiglianza di sequenza con la subunitàα di G5. Tutte queste proteine G indurre definite vie di segnalazione intracellulare che sottendono la risposta biologica per l’attivazione del recettore. A seguito di attivazione del recettore, chinasi GPCR (GRK) fosforilano la coda intracellulare dei GPCR, promuovendo in tal modo l’interazione con β-arrestins. Questo processo conduce alla cessazione di segnalazione, di desensibilizzazione e internalizzazione del recettore6G di proteine. Β-arrestins sono anche parte di complessi multi-molecolari che trigger segnalazione cascades indipendente di segnalazione7G di proteine.
GPCR sono tra i bersagli molecolari più convalidati per un intervento terapeutico, come deregolamentato GPCR-mediata di segnalazione, per esempio a causa di mutazioni con guadagno di funzione nel gene del ricevitore o sovraespressione del recettore, contribuisce all’eziologia di molti malattie umane8. Di conseguenza, GPCR rappresentano una delle più importanti classi di bersagli farmacologici studiati dall’industria farmaceutica8,9,10. Un esempio notevole di un GPCR clinicamente rilevante è il recettore di chemochine CXC 4 (CXCR4), che può essere attivato da un ligando naturale unico, le chemochine CXC (CXCL12) ligando 1211. A causa del suo ruolo stabilito come un importante co-recettore per il virus dell’immunodeficienza umana 1 (HIV-1) voce e infezione in cluster di differenziazione 4 (CD4) positivo T-linfociti12, CXCR4 in primo luogo è stato studiato come un bersaglio di farmaci antivirali. Interazione di CXCL12-CXCR4 nel midollo osseo inoltre regola la ritenzione e homing delle staminali e progenitrici delle cellule13. Inoltre, dato il suo coinvolgimento in molti aspetti del cancro biologia (ad esempio, la sopravvivenza delle cellule del tumore, metastasi, tumore-relativa angiogenesi)14 e diverse altre malattie umane (ad es., malattie infiammatorie)15, CXCR4 sollevato l’interesse significativo come un bersaglio promettente per la scoperta di nuovi farmaci. AMD3100, una piccola molecola che si rivolge specificamente CXCR4, inizialmente è stato scoperto come un anti-HIV farmaco candidato16 ed è ancora uno dei più potenti antagonisti CXCR4 descritti a data17. Suo sviluppo come un farmaco antivirale è stato, tuttavia, interrotto18. Attualmente questa molecola è usata come agente di mobilizzazione di cellule staminali durante il trattamento del mieloma multiplo e linfoma pazienti18. Diverse altre piccole molecole chimicamente indipendenti e biologics che inibiscono la funzione di CXCR4 con potenza variabile sono stati descritti19.
Metodi di associazione del ricevitore sono strumenti preziosi in farmacologia che permettono l’identificazione di composti (ad esempio, piccole molecole) che interagiscono direttamente con i GPCR di interesse. Al fine di eseguire studi di binding, non c’è nessuna necessità di conoscenza preliminare riguardante la proprietà di segnalazione intracellulare o la funzionalità di un determinato GPCR. Anche se questo può essere considerato un vantaggio, essa implica che composti per quale recettore può essere dimostrata associazione devono essere ulteriormente caratterizzata da valutare il loro potenziale attività agonista o antagonista. Questa attività può essere valutata utilizzando dosaggi farmacologici o biologiche legate alla GPCR sotto studio. Dipendente sul loro profilo di attività, molecole leganti del ricevitore potrebbero quindi potenzialmente evolvere per diventare composti di piombo romanzo per indagine negli studi pre-clinici e clinici. Molecole che si legano specificamente a un recettore ad alta affinità possono anche servire come scaffold per generare strumenti terapeutici o diagnostici, per esempio da radiolabeling li per l’imaging non invasivo in vivo del tumore le cellule20, o come potenziale veicoli per la somministrazione mirata di therapeutics21. In caso di CXCR4, è già stata dimostrata in vivo imaging delle cellule del tumore usando modelli murini in cui molecole di CXCR4-targeting con etichettate ha permesso la visualizzazione di cancro umano xenotrapianti20,22,23 .
In questo rapporto, descriviamo un protocollo dettagliato per un test di associazione di competizione che consente l’identificazione di piccole molecole e farmaci biologici che interferiscono direttamente con l’agonista (CXCL12) vincolante di CXCR4. Il principio di base del test è la competizione tra un importo fisso di ligando fluorescente contrassegnato (CXCL12AF647, Vedi tabella materiali e reagenti) e senza etichetta composti per il legame al recettore proteina17, 24. il segnale fluorescente specifico dal ligando con etichetta associato alle singole cellule che esprimono CXCR4 è quindi analizzato mediante citometria a flusso. Questo segnale fluorescente diminuisce quando adenoide piccole molecole disturbare l’interazione tra CXCL12AF647 e CXCR4. L’analisi utilizza le cellule viventi non manipolato che esprimono in modo endogeno CXCR4 (cioè, cellule Jurkat). Quindi, nessuna preparazione della membrana delle cellule è richiesta, che rende il dosaggio conveniente, veloce e compatibile con aumento della velocità. Poiché viene utilizzato un ligando fluorescente contrassegnato, radioattività è evitato.
Perché CXCL12 è l’agonista naturale per CXCR4, composti di piccola molecola che interferiscano con l’associazione di CXCL12AF647 nell’analisi sono probabilità di interagire con il sito di legame del recettore ortosterici (cioè, il sito di legame occupato dalla naturale agonista). Molecole che potrebbe interagire con siti di legame del recettore topograficamente distinti dal sito di legame ortosterici rimangano inosservati, se non influenzano il legame di CXCL12. Per esempio, modulatori allosterici positivi e negativi, una categoria importante ed emergente di GPCR targeting molecole che agiscono su allosterico associazione siti25, potenzialmente non verremo con questo test. Inoltre, se i composti identificati con questa funzione di analisi di associazione come antagonisti o agonisti non può essere derivato. Indagine dei composti identificati in ulteriori saggi relativi recettori farmacologici o funzionale così sarà richiesto. Queste analisi potrebbero includere (una combinazione di) analisi cellulare fluorescenza – o luminescenza-based per la rilevazione di secondi messaggeri (ad es., Ca2 +, monofosfato di adenosina ciclico (cAMP)), fenotipiche o saggi biologici e β-arrestina saggi di reclutamento, la cui scelta dipende dalle specifiche proprietà segnalazione dei GPCR sotto studio. Quindi, il saggio di legame competitivo descritto nel presente documento principalmente serve come un test di screening iniziale che deve essere integrata con altre analisi cell-based per consentire un’approfondita caratterizzazione di composti con potenza di legame del recettore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rispetto ad altri tipi di analisi obbligatorie (i.e., associazione di saturazione ed esperimenti di binding cinetico), concorrenza analisi obbligatorie sono più adatte ai fini dello screening. Infatti, essi consentono la valutazione di grandi lotti di composti senza etichetta, per esempio piccole molecole, segnando la loro capacità di interferire con il legame di un importo fisso di un ligando del recettore con etichetta. Composti che si legano ad altri siti del ricevitore rispetto il ligando con etichettato p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Eric Fonteyn per l’eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da KU Leuven (grant no. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, concedere no. G.485.08) e la Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSDIVA Software | |||
| BD FACSArray | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSArray System Software | |||
| Graphpad Prism | Graphpad | software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3 | |
| FlowJo | FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD. | ||
| Vi-CELL | Beckman Coulter | Not applicable | cell viability analyzer |
| Sigma 3-18 KS | Sigma | Not applicable | centrifuge |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | Pfizer | antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
| h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Jurkat cells | ATCC | ||
| Reagent reservoir PP | Sigma | BR703411 | |
| Rapid flow filter: 0.2 µm aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear | Thermo Scientific | 611U96 | |
| Falcon tubes, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 |
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