Un flusso di analisi basate su cytometry cellulare obbligatoria è descritto che è utilizzato principalmente come uno strumento di screening per identificare i composti che inibiscono il legame di un ligando di chemochine CXC fluorescente contrassegnato 12 (CXCL12) al recettore di chemochine CXC 4 (CXCR4).
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Articolo metodologico
Un'analisi di citometria-basata di flusso per identificare i composti che interrompono il grippaggio del Ligand di Chemokine CXC fluorescente etichettati 12 al recettore di chemochine CXC 4
In questo articolo
Sommario
Abstract
Targeting farmacologica dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è di grande importanza per la salute umana, come segnalazione disfunzionale GPCR-mediated contribuisce alla progressione di molte malattie. La coppia di ligando/recettore ligando di chemochine CXC 12 (CXCL12) / recettore delle chemochine CXC 4 (CXCR4) ha sollevato interesse clinico significativo, per esempio come un potenziale bersaglio per il trattamento di cancro e di malattie infiammatorie. Piccole molecole come pure gli anticorpi terapeutici specificamente destinate a CXCR4 e inibiscono la funzione del recettore sono pertanto considerati da preziosi strumenti farmacologici. Qui, un flusso cytometry cellulare test che permette l'identificazione di composti (ad esempio, piccole molecole) che abrogare CXCL12 associazione di CXCR4, è descritto. Essenzialmente, il dosaggio si basa sulla competizione per il recettore vincolante tra un importo fisso di CXCL12 fluorescente identificati, l'agonista di chemokine naturale per CXCR4 e composti senza etichetta. Quindi, in questo dosaggio è evitato l'uso indesiderabile di sonda marcata radioattivamente. Inoltre, le cellule viventi sono utilizzate come fonte di ricevitore (CXCR4) invece di preparazioni della membrana delle cellule. Questo consente il facile adattamento del dosaggio per un formato del piatto, che aumenta la velocità effettiva. Questo test ha dimostrato di essere un'analisi di scoperta del prezioso farmaco generico per identificare composti CXCR4-targeting. Il protocollo probabilmente può essere adattato ad altri GPCR, almeno se fluorescente contrassegnati ligandi sono disponibili o possono essere generati. Conoscenza preventiva riguardante le vie di segnalazione intracellulare che sono indotte all'attivazione di questi GPCR, non è necessario.
Introduzione
I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono proteine di superficie delle cellule che possono essere attivati da ligandi extracellulari (ad es., peptidi, ormoni proteici, ammine), quindi molti fisiologici e di sviluppo che regolano i processi1. Quando un agonista occupa la tasca di associazione GPCR, il cambiamento conformazionale indotto nella proteina recettore promuove il legame di proteine intracellulari associata al recettore G eterotrimeriche, composto da Gα- PIL e subunitàβγ G. Il successivo scambio di GTP per PIL sui risultati di subunitàα G nella dissociazione delle subunità G proteine (G
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Protocollo
1. manutenzione della coltura delle cellule
Nota: Tutti i passaggi descritti in 1 e 2 sono effettuati in condizioni di sterilità in un flusso laminare.
- Crescere le cellule in matracci di cultura T75 a 37 ° C e 5% di CO2 in un incubatore.
Nota: In questo test, vengono utilizzate cellule Jurkat (cioè, cellule leucemiche umane del linfocita di T che esprimono in modo endogeno CXCR417). Espressione di CXCR4 alla superficie delle cellule dovrebbe essere valutata in tutto cellula coltura mediante citometria a flusso. Una descrizione della procedura di citometria a flusso e reagenti per dete....
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Risultati
Il flusso di lavoro generale del dosaggio associazione è presentato in Figura 1A. Un'illustrazione del tipo di dati di citometria a flusso ottenuti per tipi di campioni diversi in un esperimento standard (cioè, controllo negativo, controllo positivo e campione sperimentale) è raffigurata in Figura 1Be un layout possibili piastra per eseguire il dosaggio in un formato di piastra a 96 pozzetti è dato in
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Discussione
Rispetto ad altri tipi di analisi obbligatorie (i.e., associazione di saturazione ed esperimenti di binding cinetico), concorrenza analisi obbligatorie sono più adatte ai fini dello screening. Infatti, essi consentono la valutazione di grandi lotti di composti senza etichetta, per esempio piccole molecole, segnando la loro capacità di interferire con il legame di un importo fisso di un ligando del recettore con etichetta. Composti che si legano ad altri siti del ricevitore rispetto il ligando con etichettato pot.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrei ringraziare Eric Fonteyn per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da KU Leuven (grant no. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, concedere no. G.485.08) e la Fondation Dormeur Vaduz.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Non applicabile | Dispositivo per citometria a flusso |
| BD FACSDIVA Software | |||
| BD FACSArray | Becton Dickinson | Non applicabile | Dispositivo per citometria a flusso |
| BD FACSArray System Software | |||
| Graphpad Prism | Graphpad | Pacchetto software utilizzato per l'analisi di regressione non lineare nella Figura 2 e nella Figura 3 | |
| FlowJo FlowJo | è ora una consociata interamente controllata da BD. | ||
| Vi-CELL | Beckman Coulter | Non applicabile | analizzatore di vitalità cellulare |
| Sigma 3-18 KS | Sigma | Non applicabile | centrifuga |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | antagonista specifico CXCR4 |
| Maraviroc | Pfizer | farmaco antiretrovirale, antagonista CCR5, disponibile per la ricerca presso Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
| h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | marcato fluorescentmente CXCL12, CXCL12AF647 |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| HBSS (10x), calcio, magnesio, senza rosso fenolo | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1M) | Gibco (Life Tecnologie) | 15630-056 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Celle Jurkat | Serbatoio reagente ATCC | ||
| PP | Sigma | BR703411 | |
| Filtro a flusso rapido: 0,2 &; m aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| Piastra per microtitolazione sterilizzante, 96 pozzetti, fondo a U, trasparente | Thermo Scientific | 611U96 | |
| Provette Falcon, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Pallone per coltura tissutale (T75) | Corning | 353024 |
Riferimenti
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Milligan, G., Kostenis, E.
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Ristampe e permessi
