En flyt cytometri-baserte mobilnettet bindende analysen er beskrevet som hovedsakelig brukes som en screening verktøyet for å identifisere forbindelser som hemmer binding av en fluorescently merket CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) til CXC chemokine reseptoren 4 (CXCR4).
Farmakologiske målretting av G protein-kombinert reseptorer (GPCRs) er av stor betydning for menneskets helse, som dysfunksjonelle GPCR-mediert signalering bidrar til utviklingen av mange sykdommer. Ligand/reseptor paret CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) / CXC chemokine reseptor 4 (CXCR4) har reist klinisk interesse, for eksempel som potensielle mål for behandling av kreft og inflammatoriske sykdommer. Små molekyler som terapeutiske antistoffer spesielt CXCR4 og hemme reseptorens funksjonen er derfor ansett å være verdifulle farmakologiske verktøy. Her er en flyt cytometri-baserte mobilnettet analysen der identifikasjon av forbindelser (f.eks små molekyler) som oppheve CXCL12 binding til CXCR4, beskrevet. I hovedsak er analysen avhengig av konkurransen om reseptoren binding mellom en fast mengde fluorescently merket CXCL12, naturlig chemokine Agonistiske for CXCR4 og umerkede forbindelser. Dermed unngås uønsket bruk av radioactively merket sonder i denne analysen. I tillegg brukes levende celler som kilde til reseptor (CXCR4) i stedet for celle membran forberedelser. Dette gir enkel tilpasning til analysen til en plate format, som øker. Denne analysen har vist seg å være en verdifull generisk legemiddel søk analysen identifisere CXCR4 målretting forbindelser. Protokollen kan trolig være tilpasset andre GPCRs, minst hvis fluorescently merket ligander finnes eller kan genereres. Forutgående kunnskap om de intracellulær signalveier hjulpet ved aktivering av disse GPCRs, er ikke nødvendig.
Dermed regulerer mange fysiologiske og utviklingsmessige behandler1G protein-kombinert reseptorer (GPCRs) er cellen overflaten proteiner som kan aktiveres av ekstracellulære ligander (f.eks peptider, protein hormoner, aminer). Når en Agonistiske tar sin GPCR binding lomme, indusert conformational endringen i reseptor protein fremmer binding av intracellulær reseptor-assosiert heterotrimeric G proteiner, bestående av Gα– BNP og Gβγ underenheter. Etterfølgende utveksling av GTP for BNP på Gα delenhet resultatet av de G protein underenheter (Gα-GTP og Gβγ) som, i sin tur vil ytterligere starte nedstrøms signalnettverk trasé2,3. Når Gα-GTP blir hydrolyzed, re foreningen av Gα– BNP og Gβγ underenheter vil konvertere G protein tilbake til sin hvile tilstand3,4. Forskjellige typer G proteiner eksisterer (Gs, Gi/oGq, G12/13) som kategoriseres basert på sekvens likhet med Gα delenhet5. Alle disse G proteinene indusere definerte intracellulær signalveier underlie biologiske svaret reseptor aktivisering. Etter reseptor aktivisering phosphorylate GPCR kinaser (GRKs) intracellulær halen av GPCRs, og dermed fremme samspill med β-arrestins. Denne prosessen fører til oppsigelse av G protein signalnettverk, reseptor desensitization og internalisering6. Β-arrestins er også en del av flere molekylær komplekser som utløser signalering kaskader uavhengig av G protein signalering7.
GPCRs er blant de mest validert molekylære mål for terapeutisk intervensjon, deregulated GPCR-mediert signalnettverk, for eksempel på grunn av gevinst-av-funksjon mutasjoner i reseptor genet eller reseptoren overuttrykte, bidrar til etiologien for mange menneskelige sykdommer8. Derfor representerer GPCRs en av de viktigste klassene av narkotika mål etterforsket av legemiddelindustrien8,9,10. Et godt eksempel på en klinisk relevant GPCR er CXC chemokine reseptoren 4 (CXCR4), som kan aktiveres av en eneste naturlige ligand, CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)11. På grunn av sin etablerte rolle som en stor co reseptor for humant immunsviktvirus 1 (HIV-1) oppføringen og infeksjon i cluster for differensiering 4 (CD4) positive T-lymfocytter12, CXCR4 ble først undersøkt som en antiviral stoffet. CXCL12-CXCR4 interaksjon i beinmargen ytterligere regulerer oppbevaring og homing stilk og stamfar celler13. Også gitt sitt engasjement i mange aspekter ved kreft biologi (f.eks svulst celle overlevelse, metastasering, tumor-relaterte angiogenese)14 og flere andre menneskelige sykdommer (f.eks inflammatoriske sykdommer)15CXCR4 hevet interesse som en lovende mål for medisiner. AMD3100, et lite molekyl som er spesielt rettet mot CXCR4, ble opprinnelig oppdaget en anti-HIV stoffet kandidat16 og er fortsatt en av de mest potente CXCR4 antagonister beskrevet dato17. Utviklingen avviklet som en antiviral stoffet var imidlertid18. Foreløpig brukes dette molekylet som stilk cellen mobilisering agent under behandling av myelom og lymfom pasienter18. Flere andre kjemisk urelaterte små molekyler og biologiske som hemmer CXCR4 funksjonen med varierende styrke har vært beskrevet19.
Reseptor bindende metoder er verdifulle verktøy i farmakologi at identifikasjonen av forbindelser (f.eks små molekyler) som direkte samhandler med GPCR rundt. For å utføre bindende studier, er det ikke behov for forkunnskaper for intracellulær signalnettverk egenskaper eller funksjonaliteten til en gitt GPCR. Selv om dette kan anses å være en fordel, innebærer det at forbindelser for hvilke reseptor binding kan påvises må være ytterligere preget av evaluere deres potensielle agonistic eller antagonistiske aktivitet. Denne aktiviteten kan evalueres ved hjelp farmakologiske eller biologiske analyser knyttet til GPCR under studien. Avhengig av profilen sin aktivitet, reseptor-molekyler som bindende kan deretter potensielt utvikles for å bli romanen bly forbindelser for etterforskning i prekliniske og kliniske studier. Molekyler som spesifikt bindes til en reseptor med høy affinitet kan også tjene som stillaser å generere terapeutisk eller diagnostiske verktøy, for eksempel ved radiolabeling dem for noninvasive i vivo bildebehandling tumor celler20, eller som mulig biler for målrettet levering therapeutics21. Ved CXCR4, har i vivo bildebehandling av kreftceller allerede vist bruker musen modeller der merket CXCR4 målretting molekyler tillatt visualisering av menneskelig kreft xenografts20,22,23 .
I denne rapporten beskriver vi en detaljert protokoll for en konkurransen bindende analysen som gjør identifisering av små molekyler og biologiske som direkte konflikt med Agonistiske (CXCL12) binding til CXCR4. Det grunnleggende prinsippet om analysen er konkurransen mellom en fast mengde fluorescently merket ligand (CXCL12AF647, se tabellen for materiale og reagenser) og umerkede forbindelser for å binde de reseptor protein17, 24. bestemt fluorescerende signalet fra merket ligand bundet til enkeltceller uttrykke CXCR4 er deretter analysert av flowcytometri. Fluorescerende signalet reduseres når umerket små molekyler forstyrre samspillet mellom CXCL12AF647 og CXCR4. Analysen bruker ikke-manipulert levende celler som uttrykker endogenously CXCR4 (dvs. Jurkat celler). Derfor uten cellemembranen forberedelser er nødvendig, noe som gjør analysen praktisk, rask og kompatibel med økt gjennomstrømning. Siden en fluorescently merket ligand brukes, unngås radioaktivitet.
CXCL12 er den naturlige Agonistiske for CXCR4, er små molekyl forbindelser som forstyrrer CXCL12AF647 binding i analysen sannsynlig å samhandle med orthosteric reseptor binding området (dvs. området bindende okkupert av naturlige Agonistiske). Molekyler som vil samhandle med reseptor bindende områder topografisk forskjellig fra orthosteric binding området forblir usett, hvis de ikke påvirker binding av CXCL12. For eksempel, positive og negative allosteric modulatorer, en viktig og voksende kategori av GPCR målretting molekyler opptrer på allosteric binding nettsteder25, potensielt ikke plukket med denne analysen. I tillegg om forbindelsene identifisert med bindende analysen funksjonen som reseptor antagonister eller agonister kan ikke avledes. Undersøkelse av de identifiserte forbindelsene i flere farmakologisk eller funksjonelle reseptor-relaterte analyser vil dermed være nødvendig. Disse analyser kan omfatte (en kombinasjon av) mobilnettet fluorescens – eller luminescence-baserte essay for gjenkjenning av andre messengers (f.eks, Ca2 +, syklisk adenosin monofosfat (cAMP)), fenotypiske eller biologiske metoder og β-arrestin Rekruttering analyser, valget som avhenger av spesifikke signalnettverk egenskapene til GPCR under studien. Dermed fungerer konkurransedyktige bindende analysen beskrevet heri hovedsakelig som en første screening analysen som må suppleres med andre cellebasert analyser aktivere en detaljert karakterisering av forbindelser med reseptor bindende styrke.
Sammenlignet med andre typer bindende analyser (dvs. metning bindende og kinetisk bindende eksperimenter), er konkurransen bindende analyser best egnet for screening formål. Faktisk, de tillater evaluering av store grupper av umerkede forbindelser, for eksempel små molekyler, scoret deres evne til å påvirke bindingen for et fast beløp på en merket reseptor ligand. Forbindelser som binder seg til andre reseptor nettsteder enn merket ligand kan forbli uoppdaget i analysen. Selv om konkurransen bindende ekspe…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Eric Fonteyn for utmerket kundestøtte. Dette arbeidet har vært støttet av KU Leuven (gi nei. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (CVE, gir ingen. G.485.08) og Fondation Dormeur Vaduz.
BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
BD FACSDIVA Software | |||
BD FACSArray | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
BD FACSArray System Software | |||
Graphpad Prism | Graphpad | software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3 | |
FlowJo | FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD. | ||
Vi-CELL | Beckman Coulter | Not applicable | cell viability analyzer |
Sigma 3-18 KS | Sigma | Not applicable | centrifuge |
AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | specific CXCR4 antagonist |
Maraviroc | Pfizer | antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
HEPES (1M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
Jurkat cells | ATCC | ||
Reagent reservoir PP | Sigma | BR703411 | |
Rapid flow filter: 0.2 µm aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear | Thermo Scientific | 611U96 | |
Falcon tubes, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 |