Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para identificar compostos que interrompem a ligação do ligante de Chemokine fluorescente-etiquetadas CXC 12 a CXC Chemokine Receptor 4
Summary
Um fluxo de ensaio de ligação celular baseados em citometria é descrito que é usado principalmente como uma ferramenta de triagem para identificar compostos que inibem a ligação de um ligante de chemokine CXC fluorescente etiquetada 12 (CXCL12) para o receptor do chemokine CXC 4 (CXCR4).
Abstract
Como alvo farmacológico dos receptores de acoplado à proteína G (GPCRs) é de grande importância para a saúde humana, como disfuncional GPCR mediada por sinalização contribui para a progressão de muitas doenças. O par ligante/receptor ligante de chemokine CXC 12 (CXCL12) / receptor do chemokine do CXC 4 (CXCR4) tem gerado interesse clínico significativo, por exemplo, como um alvo em potencial para o tratamento de câncer e doenças inflamatórias. Pequenas moléculas, bem como anticorpos terapêuticos que especificamente alvo CXCR4 e inibem a função do receptor, portanto, são considerados valiosas ferramentas farmacológicas. Aqui, um fluxo baseados em citometria celular ensaio que permite a identificação de compostos (por exemplo, pequenas moléculas) que revogará CXCL12 vinculação de CXCR4, é descrita. Essencialmente, o ensaio se baseia na competição para receptor vinculação entre uma quantidade fixa de CXCL12 fluorescente etiquetadas, o agonista chemokine natural para CXCR4 e compostos sem rótulo. Portanto, é evitar a utilização indesejável de sondas radioactivamente marcadas neste ensaio. Além disso, as células vivas são usadas como a fonte do receptor (CXCR4) ao invés de preparações de membrana celular. Isto permite uma fácil adaptação do ensaio para um formato de chapa, o que aumenta a taxa de transferência. Este ensaio tem demonstrado ser um ensaio de descoberta valiosa medicamento genérico para identificar compostos CXCR4-direcionamento. O protocolo pode provavelmente ser adaptado para outros GPCRs, pelo menos se fluorescente etiquetadas ligantes estão disponíveis ou podem ser gerados. Conhecimento prévio sobre as vias de sinalização intracelulares que são induzidas após a ativação destas GPCRs, não é necessário.
Introduction
G receptores (GPCRs) são proteínas de superfície celular que podem ser ativadas por ligantes extracelulares (por exemplo, peptídeos, hormônios proteicos, aminas), desse modo regular muitos fisiológicos e do desenvolvimento de processos1. Quando um agonista ocupa seu bolso de vinculação GPCR, a mudança conformacional induzida da proteína do receptor promove a ligação de proteínas intracelulares associadas do receptor via G, consistindo de Gα– PIB e Gβγ subunidades. A subsequente troca de GTP para PIB sobre os resultados de subunidadeα G na dissociação das subunidades de proteína G (Gα-GTP e Gβγ) que, por sua vez, ainda mais iniciará a jusante sinalizando caminhos2,3. Quando o Gα-GTP se torna hidrolisado, re-associação da Gα– PIB e Gβγ subunidades irão converter a proteína G volta em seu descanso de3,de estado4. Tipos distintos de proteínas G existem (Gs, G,i/o, Gq, G12/13), que são classificados com base na similaridade de sequência com o de subunidadeα G5. Todas estas proteínas G induzem definidas vias de sinalização intracelulares que fundamentam a resposta biológica à ativação do receptor. Na sequência de ativação do receptor, quinases GPCR (GRKs) fosforilar a cauda intracelular de GPCRs, promovendo a interação com β-arrestins. Este processo leva à rescisão da proteína G, sinalização,6, de dessensibilização e internalização do receptor. Β-arrestins também são parte dos complexos multi moleculares que gatilho sinalizando cascatas independentes da proteína G sinalização7.
GPCRs estão entre os alvos moleculares mais validados para a intervenção terapêutica, como desregulamentado GPCR mediada por sinalização, por exemplo devido a mutações de ganho de função no gene do receptor ou superexpressão do receptor, contribui para a etiologia de muitas doenças humanas8. Portanto, GPCRs representam uma das mais importantes classes de alvos de drogas investigados pela indústria farmacêutica8,9,10. Um exemplo notável de um GPCR clinicamente relevante é a CXC receptor do chemokine 4 (CXCR4), que pode ser ativado por um ligante natural único, o CXC chemokine ligante 12 (CXCL12)11. Devido ao seu papel estabelecido como um grande receptor de co para vírus de imunodeficiência humana 1 (HIV-1) entrada e infecção em cluster de diferenciação 4 (CD4) positivo linfócitos T12, CXCR4 primeiro foi investigada como alvo uma droga antiviral. CXCL12-CXCR4 interação na medula óssea mais regula a retenção e orientação de tronco e progenitor células13. Também, dado o seu envolvimento em muitos aspectos do câncer biologia (por exemplo, sobrevivência de células de tumor, metástase, relacionados ao tumor angiogênese)14 e várias outras doenças humanas (por exemplo, doenças inflamatórias)15, CXCR4 criou um interesse significativo como um alvo promissor para a descoberta de medicamentos. AMD3100, uma pequena molécula que se destina especificamente a CXCR4, descobriu-se, inicialmente, como uma droga de anti-HIV candidato16 e ainda é um dos mais potentes antagonistas CXCR4 descritos a data17. Seu desenvolvimento como uma droga antiviral foi, no entanto, descontinuado18. Atualmente, esta molécula é usada como um agente de mobilização de células-tronco durante o tratamento de pacientes de mieloma múltiplo e linfoma18. Várias outras moléculas pequenas quimicamente independentes e produtos biológicos que inibem a função de CXCR4 com potência variando foram descritos19.
Métodos de ligação do receptor são ferramentas valiosas em farmacologia que permitem a identificação de compostos (por exemplo, pequenas moléculas) que interagem diretamente com o GPCR de interesse. Para realizar estudos de ligação, não há nenhuma necessidade de conhecimento prévio sobre a funcionalidade de um determinado GPCR ou a propriedades de sinalização intracelulares. Embora isto pode ser considerado uma vantagem, sugere que compostos que receptor vinculação pode ser demonstrada precisam ainda mais ser caracterizada através da avaliação da sua potencial atividade agonística ou antagônica. Esta atividade pode ser avaliada usando ensaios farmacológicos, ou biológicos relacionados com o GPCR sob estudo. Dependente de seu perfil de atividade, moléculas de ligação do receptor podem então potencialmente evoluir para tornar-se os compostos de chumbo romance para investigação em estudos pré-clínicos e clínicos. As moléculas que se ligam especificamente a um receptor com alta afinidade também podem servir como andaimes para gerar ferramentas de diagnósticos ou terapêuticas, por exemplo, os radioativos para a imagem latente não-invasiva na vivo de células de tumor20, ou como potencial veículos para entrega alvo da terapêutica21. Em caso de CXCR4, imagem latente na vivo de células tumorais já foi demonstrado usando modelos de rato onde moléculas CXCR4-direcionamento rotuladas permitiu a visualização de câncer humano xenografts20,22,23 .
Neste relatório, descrevemos um protocolo detalhado para um ensaio de vinculação de competição que permite a identificação de moléculas pequenas e produtos biológicos que interferem diretamente com agonista (CXCL12) vinculativa de CXCR4. O princípio básico do ensaio é a concorrência entre uma quantidade fixa de ligante fluorescente etiquetada (CXCL12AF647, consulte tabela de materiais e reagentes) e unlabeled compostos para a ligação com o receptor da proteína17, 24. o sinal fluorescente específico do ligante rotulado vinculado a única células expressando CXCR4 é então analisado por citometria de fluxo. Este sinal fluorescente diminui quando as moléculas pequenas sem rótulo perturbam a interação entre CXCL12AF647 e CXCR4. O ensaio utiliza células de vida não-manipulada que expressam endogenamente CXCR4 (i.e., células Jurkat). Portanto, nenhuma preparação da membrana celular é necessária, o que torna o ensaio conveniente, rápido e compatível com maior throughput. Desde que é usado um ligante fluorescente etiquetado, radioatividade é evitada.
Porque CXCL12 é o agonista natural para CXCR4, compostos de pequenas moléculas que interferem com a vinculação de CXCL12AF647 no ensaio são susceptíveis de interagir com o sítio de ligação orthosteric do receptor (ou seja, o sítio de ligação ocupado pelo natural agonista). Moléculas que iria interagir com locais de ligação do receptor topograficamente distintas do local de ligação do orthosteric despercebido, se elas não influenciam a vinculação de CXCL12. Por exemplo, moduladores alostéricos positivos e negativos, uma categoria importante e emergente de GPCR como alvo moléculas atuando em sítios de ligação alostéricos25, serão potencialmente não apanhados com este ensaio. Além disso, se os compostos identificaram com esta função de ensaio de ligação como antagonistas dos receptores ou como agonistas não podem ser derivado. Investigação dos compostos identificados em adicionais ensaios relacionados ao receptor farmacológicos ou funcionais, portanto, serão necessária. Estes ensaios podem incluir (uma combinação de) celular fluorescência ou luminescência-com base em ensaios para a detecção de segundo mensageiros (por exemplo, Ca2 +, adenosina monofosfato cíclica (cAMP)), fenotípicas ou ensaios biológicos e β-arrestin ensaios de recrutamento, a escolha dos quais depende as propriedades específicas de sinalização do GPCR sob estudo. Portanto, o ensaio de ligação competitiva descrito neste documento principalmente serve como um ensaio de triagem inicial que precisa de ser complementada com outros ensaios cell-based para permitir uma caracterização aprofundada de compostos com potência de ligação do receptor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ensaios obrigatórios de concorrência em comparação a outros tipos de ensaios obrigatórios (ou seja, a vinculação de saturação e experimentos de cinética de ligação), são mais adequados para fins de triagem. Na verdade, eles permitem avaliação de grandes lotes de compostos sem rótulo, por exemplo, pequenas moléculas, marcando sua capacidade de interferir com a ligação de uma quantidade fixa de um ligante-receptor rotulada. Compostos que se ligam a outros locais do receptor do que o ligante rotu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer Eric Fonteyn excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo KU Leuven (conceder n. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, conceder n. G.485.08) e a Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSDIVA Software | |||
| BD FACSArray | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSArray System Software | |||
| Graphpad Prism | Graphpad | software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3 | |
| FlowJo | FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD. | ||
| Vi-CELL | Beckman Coulter | Not applicable | cell viability analyzer |
| Sigma 3-18 KS | Sigma | Not applicable | centrifuge |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | Pfizer | antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
| h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Jurkat cells | ATCC | ||
| Reagent reservoir PP | Sigma | BR703411 | |
| Rapid flow filter: 0.2 µm aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear | Thermo Scientific | 611U96 | |
| Falcon tubes, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 |
Riferimenti
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