Vorbereitung der murinen mandibulären Speicheldrüse aufrecht Intravitalen Mikroskopie
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll zur chirurgisch freizulegen und Stabilisierung der murinen mandibulären Speicheldrüse intravitalen Bildgebung mit aufrechten intravitalen Mikroskopie. Dieses Protokoll ist leicht anpassbar an anderen therapeutisches Drüsen von Kopf und Hals-Bereich der Mäuse und andere kleine Nagetiere.
Abstract
Die submandibulären Speicheldrüse (SMG) ist eines der drei großen Speicheldrüsen und ist von Interesse für viele verschiedene Bereiche der biologischen Forschung, einschließlich der Zelle Biologie, Zahnmedizin, Onkologie und Immunologie. Die SMG ist ein therapeutisches Drüse bestehend aus sekretorische Epithelzellen, Myofibroblasts endothelial Zellen, Nerven und extrazelluläre Matrix. Dynamische zelluläre Prozesse in der Ratte und Maus SMG haben zuvor abgebildet, meist mit Multi-Photonen Mikroskopsystemen invertiert. Hier beschreiben wir eine einfache Protokoll für die chirurgische Vorbereitung und Stabilisierung der murinen SMG im narkotisierten Mäuse für in-Vivo Bildgebung mit aufrechten Multi-Photonen Mikroskopsysteme. Wir präsentieren repräsentative intravitalen Bildsätze endogener und adoptively übertragen fluoreszierende Zellen, einschließlich der Kennzeichnung von Blutgefäßen oder Speichel Kanäle und zweite harmonische Generation Fibrillären Kollagen zu visualisieren. Zusammenfassend lässt sich sagen ermöglicht unser Protokoll chirurgische Vorbereitung der Maus Speicheldrüsen in aufrechte Mikroskopiesysteme, die üblicherweise für intravitalen Bildgebung auf dem Gebiet der Immunologie verwendet werden.
Introduction
Speichel abgesondert durch therapeutisches Drüsen zu essen zu schmieren, schützen die Schleimhaut-Oberflächen des oralen Traktes und liefern Verdauungsenzyme sowie antimikrobielle Substanzen1,2. Neben kleinen Speicheldrüsen in der mündlichen Submukosa durchsetzt gibt es drei bilaterale Sätze von großen Drüsen als Parotis, sublinguale und submandibulären, entsprechend ihrer Lage1,2. Pyramidenförmige Epithelzellen in Kolben-förmigen Säcke (Azini) organisiert oder Lünetten, die myoepithelialen Zellen und einer Basalmembran umgeben sezernieren die serösen und Schleimhaut Komponenten der Speichel1. Die engen luminalen Raum der Azini Gullys in eingefügten Leitungen, die in gekerbten Leitungen zu verbinden, bis sie schließlich in einem einzigen ausführungsgang1teilnehmen. Die wichtigsten ausführungsgang von der SMG heißt Wharton Rohr (WD) und mündet in die sublingual Karunkel3,4. Das SMG epitheliale Fach stellt daher eine stark verzweigten Struktur mit vielfältigen terminal Endpunkte, ähnlich wie ein Bündel Trauben1,5,6. Die SMG Interstitium besteht aus Blut und lymphatische Behälter eingebettet in Bindegewebe7 , die parasympathischen Nerven8 und extrazelluläre Matrix5enthalten. Normale menschliche und Nagetier Speicheldrüsen enthalten auch T-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen9, sowie Plasmazellen, die Immunglobulin absondern (IgA) in den Speichel9,10. Die SMG ist aufgrund seiner vielfältigen Funktionen in Gesundheit und Krankheit ein Thema von Interesse für viele Bereiche der biologischen Forschung, einschließlich Zahnmedizin4, Immunologie11, Onkologie12, Physiologie8und Zellbiologie 3.
Bildgebung der dynamische zelluläre Prozesse und Wechselwirkungen ist ein mächtiges Werkzeug in der biologischen Forschung13,14. Die Entwicklung der Tiefenmassage Bildgebung und Innovationen Inmicroscopes basierend auf nichtlineare Optik (NLO), die Streuung und Absorption von mehreren Photonen durch die Probe verlassen, darf direkt zelluläre Prozessen in komplexen Gewebe13 untersuchen ,15. Absorption von mehreren Photonen umfasst die Lieferung von insgesamt Anregungsenergie von niederenergetischen Photonen, welche Grenzen Fluorophor Erregung auf der Brennebene und somit tieferes Gewebe eindringen mit reduzierten lichtbedingten und Lärm von außerhalb der Fokus Erregung13,15. Dieses Prinzip wird durch die zwei-Photonen-Mikroskopie (14:00) eingesetzt und ermöglicht die Abbildung von fluoreszierenden Proben in Tiefen von bis zu 1 mm15,16. Während handelsübliche 14:00, die Setups benutzerfreundlich und zuverlässig geworden sind, ist die größte Herausforderung für die intravitalen Bildgebung sorgfältig setzen und stabilisieren das Zielorgan der narkotisierten Mäuse, vor allem für die Darstellung von Time-Lapse-Serie. Mehrere Methoden für digitale Drift-Korrektur nach der Datenerfassung wurden veröffentlicht17,18 und wir vor kurzem entwickelt “VivoFollow”, eine automatische Korrektur-System, die langsame Gewebe Drift in Echtzeit mit entgegenwirkt ein computerisierte Stufe19. Es ist jedoch nach wie vor kritisch für hochwertige Bildgebung zur Minimierung von Gewebe Bewegung, vor allem schnelle Bewegungen, die durch Atmung oder Herzschlag19. Vorbereitung und Stabilisierung Verfahren wurden für mehrere Organe, einschließlich Rückenmark20, Leber21Haut22, Lungen-23und Lymphknoten24veröffentlicht. Darüber hinaus Modelle für die Ratte Speicheldrüse Bildgebung weiter verfeinert für hochauflösende intravitalen Bildgebung der Murine SMG auf einem inversen Mikroskop Setup26, zugeschnitten und wurden entwickelten3,25 27 , 28.
Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische und anpassungsfähige Protokoll für intravitalen Bildgebung der murinen SMG mit aufrechten nichtlineare Mikroskopie, die häufig zur intravitalen Bildgebung auf dem Gebiet der Immunologie dient. Zu diesem Zweck haben wir eine weithin eingesetzten Immobilisierung Bühne für popliteal Lymphknoten Vorbereitungen verwendet geändert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll bietet eine einfache Lösung für die in-Vivo Bildgebung der murinen mandibulären und sublingualen Speicheldrüsen mit aufrechten nichtlineare Mikroskopie verwendet oft auf dem Gebiet der Immunologie. Die Methode kann für die Darstellung der anderen therapeutisches Drüsen in der Kopf-Hals-Bereich angepasst werden. Zum Beispiel hat unser Labor Bildgebung die Tränendrüse in analoger Weise (nicht dargestellt) durchgeführt.
Entfernen das Bindegewebe um die SMG ist d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (SNF) Projekt Grant 31003A_135649, 31003A_153457 und 31003A_172994 (zu JVS) und Leopoldina Gemeinschaft LPDS 2011-16 (BS) finanziert. Diese Arbeit profitiert, optische Konfigurationen des “Microscopy Imaging Center” (MIC) der Universität Bern.
Materials
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
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