適応 3' CDNA の急速な拡大は、がんの成績証明書をマップする終了します。

Summary

(3′ レース) の cDNA の端の 2 つ異なる 3′ 急速な拡大はプロトコル説明ここで作るのオープンリーディング フレーム (ORF)、停止コドンと全体 3′ UTR の RNA を使ってセグメントを含むシーケンスにマップする 2 つの異なる DNA ポリメラーゼの使用異なるがん細胞から得られます。

Abstract

真核生物 Mrna の成熟には、ポリ a 尾部の付加を含む 3′ 端形成が含まれます。遺伝子の 3′ 末端をマップするために選択する従来の方法は (3′ レース) の cDNA の端の急速な拡大は 3′ です。3′ 競争のプロトコルには、入念な設計と興味のターゲット遺伝子の 3′ 非翻訳領域 (3′ UTR) 内でネストされたプライマーの選択が必要です。ただし、いくつかの変更で全体 3′ UTR と ORF と 3′ UTR の関係のより包括的な画像を提供するオープンリーディング フレーム (ORF) 内のシーケンスを含めるプロトコルを使用できます。これは従来 3′ 競争によって提供される、胸の谷間と起こるサイトだけでなく、起こる信号 (PAS) の識別に加えてです。拡張された 3′ レース珍しい 3′ 3′ UTR、内融合遺伝子を含む UTRs を検出できるし、AU 豊富なトラン スクリプトの安定性に影響を与える要素の不安定化と同様、潜在的なマイクロ Rna 結合部位を予測するシーケンス情報を使用できます。

Introduction

3′ 末端の形成は、ポリ a テール^1,2を作る ~ 250 untemplated アデニンの添加に続いて PAS のプレ mRNA の下流の胸の谷間を含む mRNA 成熟の重要なステップです。ポリ a 結合蛋白質 (PABP) ポリ a の尾に、これは、劣化から mRNA の転写を保護し、容易に翻訳¹。

現在の推定では、ひと遺伝子の 70% を複数のパスを持ってしたがって代替起こる、結果は複数の 3′ 端³を受けるとを示唆しています。したがって、任意の特定のコピーで使用される PAS を識別し同様、ポリ a の尾が 3′ UTR の残りの部分に接続する位置を特定することが重要です。次世代シーケンシングの出現は UTRs とたくさんの遺伝子の 3′ の同時同定になりました。シーケンス機能のこの増加は、3′ 末端の代替起こるに関連するデータを分析するバイオインフォマティクス アルゴリズムの開発を求められています。De novo検出や PAS の検証、それゆえ大規模な配列データから個々 の遺伝子の 3′ 末端のマッピング、3′ レース選択^4、5の方法のままです。通常 3′ 競争の cDNA 製品に含まれるシーケンスには 3′ UTR ポリ a の尾、胸の谷間サイト、PAS および PAS の上流のシーケンスが含まれている部分だけが含まれます。3′ レースはデザインと遺伝子特定の前方および逆のプライマーの使用必要とする PCR とは異なり、2 つの遺伝子特定入れ子になった前方プライマーのみ必要があります。したがって、PCR 増幅^4,6をされている遺伝子の大きな領域の塩基配列の詳細な知識が必要です。3′ レースを使用するので同じ逆、ポリ a テールすべて polyadenylated RNA 転写産物のターゲット、前方プライマーのみする必要がある遺伝子を特定、したがって、だけ mRNA の非常に小さい領域の知識を必要とする入門書です。これにより、そのシーケンスがあります完全に特徴づけられる^4,7の領域の増幅。これは、3′ だけでなく遺伝子の 3′ 終わりを決定するが、また判断して上流 3′ UTR の重要な部分を形成する PAS の大きい地域を特徴づけるのための競争を許可しています。5′ 変更された 3′ 3′ UTR のより大きい部分と並ぶ地域を含むレースとレースを組み合わせて、完全にシーケンスまたは 3′ 端⁸に 5′ 端から全体 mRNA のコピーのクローンを作成することが可能です。

この変更された 3′ 競争の適用の例は、小説CCND1 MRCK融合遺伝子転写マントル細胞リンパ腫細胞株およびがん患者からの最近の id です。3′ UTR CCND1とMRCKの両方の遺伝子配列から成り、miRNA 規制⁹に反抗しました。2 つ入れ子になったCCND1特定前方プライマーがすぐに隣接してCCND1の終止コドンの下流領域に補足。財源やバイオ情報を作る専門知識に多くの研究所がない場合があります特定 bioinformatic ツールと共に全体のトランスクリプトーム シーケンスを使用して、3′ UTR¹⁰内遺伝子融合を検出できますが、この技術を使って。したがって、3′ レースは 3′ UTR を含む新規融合遺伝子のde novoの識別と確認のための代替。考えると、抜本的な報告された融合遺伝子の数の増加し同様に議事録を読んで、3′ レース ツールとなっている強力な遺伝子シーケンス^11,12を特徴付けること。また、最近の研究は、3′ UTR の長さと同様、そのさまざまなシーケンス内で 3′ UTR mRNA 転写安定性、ローカリゼーション、訳し、および関数¹³に影響することができますを示しています。関心の高まりの一部によるトランスクリプトームをマッピングの研究室で使用するため開発されている種類の DNA ポリメラーゼの数が増加しています。どのような種類の変更させることができます 3′ DNA ポリメラーゼの使用可能なレパートリーを活用するための競争のプロトコルを決定することが重要です。

この作業を適応 3′ マップ全体 3′ UTR にレース レポート、PAS とを使用してANKHD1の転写産物の 3′ 終わり胸の谷間サイト ネスト トラン スクリプトの 2 つの種類の DNA ポリメラーゼANKHD1セクション内のプライマー。

Protocol

このプロトコルのすべてのプロシージャの実行中は常に白衣、手袋と安全メガネを着用します。フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸試薬容器/チューブが認定フードで指定されたコンテナー内のフェノール廃棄物処分のみ開かれているを確認します。DNAse、RNAse フリーの生殖不能の管、ヒント、および試薬を使用します。 1. 細胞培養 HeLa 細胞ラインと 2 ?…

Representative Results

入れ子になった前方プライマー検索: Agarose のゲルから使用する同じ転送別逆プライマーはプライマー 2 個別 PCR のゲル製品 (レーン 1 と 2) を図 1に示します。レーン 3 個別 PCR の製品、異なる前方および逆プライマーを有しています。理想的なプライマーによる PCR 反応に使用する、1 種類?…

Discussion

遺伝子によ遺伝子単位での大規模な並列シーケンス技術の出現にもかかわらず 3′ レースまだまま PAS とポリ a の尾に隣接したヌクレオチドを識別する最も簡単なと最も経済的な方法です。ここで説明した適応は 3′ レースを使用して両方を増幅し、ORF、終止コドンと全体 3′ UTR ANKHD1 mRNA のコピーの部分を含むシーケンスをマップするを展開します。3′ 競争の主な利点は、いくつかのマイ?…

Materials

HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.