Tilpasse 3' slutter hurtige forstærkning af CDNA for at kortlægge udskrifter i kræft

Summary

De to forskellige 3′ hurtige forstærkning af cDNA ender (3′ RACE) protokoller beskrevet her gøre brug af to forskellige DNA polymeraser til at knytte sekvenser, der omfatter et segment af åben behandling ramme (ORF), stop-codon og den hele 3′ UTR af et udskrift ved hjælp af RNA fremstillet af forskellige kræft cellelinjer.

Abstract

Modning af eukaryote mRNAs indebærer 3′ enden dannelse, som omfatter tilføjelse af en poly(A) hale. For at kortlægge 3′ enden af et gen, er den traditionelle metode til valg 3′ hurtige forstærkning af cDNA ender (3′ RACE). Protokoller for 3′ RACE kræver omhyggelige design og valg af indlejrede primere i den 3′ utranslaterede region (3′ UTR) target-gen af interesse. Dog med et par ændringer kan til protokollen bruges til at omfatte hele 3′ UTR og sekvenser i åben læsning rammen (ORF), giver et mere omfattende billede af forholdet mellem ORF og 3′ UTR. Dette er ud over identifikation af polyadenylation signalet (PAS), og på spaltning og polyadenylation webstedet leveres af konventionelle 3′ RACE. Udvidet 3′ RACE kan opdage usædvanlige 3′ UTRs, herunder gen fusioner inden for 3′ UTR, og sekvensen oplysninger kan bruges til at forudsige potentielle miRNA bindingssteder samt AU rige destabiliserende elementer, der kan påvirke stabiliteten i afskriften.

Introduction

Dannelsen af 3′-enden er et kritisk skridt i mRNA modning, der omfatter kløvningen af pre-mRNA nedstrøms for et PAS, efterfulgt af tilsætning af ~ 250 untemplated adenines, som udgør poly(A) hale^1,2. Poly(A) bindende protein (PABP) bindes til poly(A) hale, og dette beskytter mRNA udskrift fra nedbrydning, og letter oversættelse¹.

Aktuelle skøn viser, at 70% af menneskelige gener har flere PASs, og således gennemgår alternative polyadenylation, hvilket resulterer i flere 3′ ender³. Det er således vigtigt at identificere hvor poly(A) hale tillægger resten af 3′ UTR, samt identificere de PAS, anvendes af enhver given udskrift. Fremkomsten af næste generation sequencing har resulteret i den samtidige identifikation af 3′ UTRs og PASs af tusindvis af gener. Denne stigning i sekventering kapacitet har kræves udvikling af bioinformatic algoritmer til analyse af data vedrørende alternative polyadenylation i 3′ enden. For de novo påvisning eller validering af PAS og dermed tilknytning til 3′ enden af enkelte gener fra store skala sequencing data, forbliver 3′ RACE metode valg^4,5. De sekvenser, der er inkluderet i cDNA produkter af 3′ RACE normalt omfatter kun en del af 3′ UTR, der indeholder poly(A) hale, webstedet kavalergang, PAS og sekvenser opstrøms af PAS. I modsætning til PCR, som kræver udformning og anvendelse af genet specifikke frem og bak primere, kræver 3′ RACE kun to gen specifikke indlejrede fremad primere. Derfor, PCR kræver en mere detaljeret viden om nucleotidsekvensen af en stor region af genet bliver forstærket^4,6. Siden 3′ RACE bruger omvendt det samme primer at mål poly(A) hale for alle polyadenylated RNA udskrifter, kun de forreste primere skal gen specifikke, således kun kræver kendskab til en betydeligt mindre region i mRNA. Dette giver mulighed for forstærkning af regioner, hvis sekvenser ikke er fuldt karakteriseret^4,7. Dette har tilladt 3′ RACE skal bruges ikke kun til at bestemme 3′ enden af et gen, men at også bestemme og karakterisere store områder opstrøms i de PAS, der udgør en betydelig del af 3′ UTR. Ved at kombinere 5′ RACE med den modificerede 3′ RACE, der omfatter større dele af 3′ UTR og flanken regioner, er det muligt at fuldt sekvens eller klone en hele mRNA udskrift fra 5′-enden til sine 3′ enden⁸.

Et eksempel på denne anvendelse af modificerede 3′ RACE er den seneste identifikation af en roman CCND1-MRCK fusion gen udskrift fra Mantle celle lymfom cellelinjer og kræftpatienter. 3′ UTR bestod af sekvenser fra både CCND1 og MRCK gener og var genstridige miRNA forordning⁹. De to indlejrede CCND1 specifikke fremad primere var supplement til området umiddelbart tilstødende og neden for CCND1 stop-codon. Selv om hele transkriptom sekventering sammen med specifikke bioinformatic værktøjer kan anvendes til at påvise gen fusioner inden for 3′ UTR¹⁰, mange laboratorier kan manglende finansielle midler eller bioinformatic ekspertise til at gøre brug af denne teknologi. Derfor, 3′ RACE er et alternativ til de novo identifikation og validering af nye fusion gener der involverer 3′ UTR. I betragtning af den drastiske stigning i antallet af rapporterede fusion gener samt læse gennem afskrifter, er 3′ RACE blevet et stærkt værktøj i kendetegner gen sekvenser^11,12. Derudover har nylige undersøgelser vist, at forskellige sekvenser i 3′ UTR såvel som længden af 3′ UTR kan påvirke mRNA udskrift stabilitet, lokalisering, translatability og funktion¹³. Delvis på grund af en øget interesse i kortlægning af transkriptom, har der været en stigning i antallet af forskellige DNA polymeraser der udvikles til brug i laboratoriet. Det er vigtigt at fastslå, hvad slags ændringer kan være foretaget 3′ RACE protokol i for at udnytte det tilgængelige repertoire af DNA polymeraser.

Dette arbejde rapporter tilpasning 3′ RACE at kortlægge den hele 3′ UTR, PAS, og 3′ enden kavalergang site af ANKHD1 udskrift ved hjælp af indlejret primere i afsnittet ANKHD1 i afskriften og to forskellige DNA polymeraser.

Protocol

Bære en laboratoriekittel, handsker og sikkerhedsbriller til enhver tid mens de udfører alle procedurer i denne protokol. Sikre, at containere/rør indeholdende phenol og guanidin isothiocyanat reagens kun åbnes i et certificeret hood og bortskaffe phenol affald i en udpegede container. Bruge DNAse/RNAse-fri sterile rør, tips og reagenser. 1. cellekultur Vokse linjen HeLa celler og to suspension mantle celle lymfom cellelinjer, Granta-519 og Jeko-1, i DMEM som indeholder 10% FBS …

Representative Results

Indlejrede fremad Primer søgning: Agarosegel fra Figur 1 viser to forskellige PCR gel produkter (spor 1 og 2) hvilken brug de samme videresende primer men forskellige omvendt primere. Lane 3 har en særskilt PCR produkt og har en særskilt frem og bak primer. De ideelle primere til brug for PCR baseret reaktion er dem, der giver en særskilt PCR produkt (Lane 3). Den fremad primer anv…

Discussion

På trods af fremkomsten af massive parallelle sekventering teknologier, på grundlag af genet af genet, 3′ RACE er stadig den nemmeste og mest økonomiske metode til at identificere de PAS og nukleotider støder op til poly(A) hale. Tilpasning beskrives her udvides ved hjælp af 3′ RACE til både forstærke og knytte sekvenser, der omfatter en del af ORF, stop-codon og den hele 3′ UTR af ANKHD1 mRNA udskrift. En stor fordel ved 3′ RACE er, at med et par mindre tilpasninger, produkter fra 3′ RACE kan klones til …

Materials

HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.