Adaptation de 3' Amplification rapide des ADNc se termine pour mapper les transcriptions en Cancer
Summary
Deux différentes 3′ amplification rapide des extrémités d’ADNc (3′ course) protocoles décrit ici faire usage de deux différents ADN polymérases pour mapper les séquences qui incluent une partie de la trame de lecture ouverte (ORF), le codon d’arrêt et l’entière région 3′ UTR de transcription utilisant l’ARN issus de lignées de cellules cancéreuses différent.
Abstract
La maturation des ARNm eucaryotes implique 3′ fin formation qui implique l’addition d’une queue poly (a). Afin de cartographier l’extrémité 3′ d’un gène, la méthode traditionnelle de choix est 3′ amplification rapide des extrémités d’ADNc (3′ RACE). Protocoles pour 3′ RACE nécessitent la conception soignée et la sélection des amorces imbriquées au sein de la région 3′ non traduite (3′ UTR) du gène cible d’intérêt. Cependant, avec quelques modifications, le protocole peut être utilisé pour inclure l’entière région 3′ UTR et séquences dans le cadre de lecture ouvert (ORF), fournissant une image plus complète de la relation entre l’ORF et la région 3′ UTR. Il s’agit en plus d’identifier le signal de polyadénylation (Fe), ainsi que le site de clivage et polyadénylation fourni par classiques 3′ RACE. Expansé 3′ RACE peut détecter insolite 3′ UTR, y compris des fusions de gènes au sein de la région 3′ UTR, et les informations de séquence peuvent être utilisées pour prédire le potentiel miRNA accepteurs comme AU riche déstabiliser les éléments qui peuvent affecter la stabilité de la transcription.
Introduction
La formation de l’extrémité 3′ est une étape cruciale dans la maturation des ARNm qui comprend le clivage de l’ARN pré-messager en aval d’un PAS suivie par l’ajout de ~ 250 untemplated adénines, qui forment la queue poly (a)1,2. La protéine de liaison de poly (a) (PABP) se lie à la queue poly (a), et cela protège la transcription de l’ARNm de la dégradation et facilite la traduction1.
Les estimations actuelles suggèrent que 70 % des gènes humains ont plusieurs PASs et donc subir une alternative polyadénylation, entraînant plusieurs extrémités de 3′3. Ainsi, il est important d’identifier où la queue poly (a) s’adapte sur le reste de la région 3′ UTR, en plus d’identifier les FE utilisés par toute transcription donnée. L’avènement de la nouvelle génération de séquençage a entraîné l’identification simultanée de la 3′ UTR et le col de milliers de gènes. Cette augmentation de capacité de séquençage a nécessité le développement d’algorithmes bioinformatiques pour analyser les données impliquant la polyadénylation alternative de l’extrémité 3′. Pour la détection de novo ou la validation du PAS et par conséquent de cartographie de l’extrémité 3′ des gènes individuels de données de séquençage à grande échelle, 3′ RACE reste la méthode de choix4,5. Les séquences incluses dans les produits de cDNA de 3′ course normalement n’incluent qu’une partie de la région 3′ UTR qui contient la queue poly (a), le site de clivage, le PAS et les séquences en amont du PAS. Contrairement à la PCR, qui requiert la conception et l’utilisation des amorces spécifiques et inverses de gène, 3′ RACE ne nécessite que deux gènes imbriqué avant des amorces spécifiques. Par conséquent, PCR requiert une connaissance plus détaillée de la séquence nucléotidique d’une grande région du gène étant amplifiés4,6. Depuis 3′ RACE utilise le même inverser apprêt que cibles la poly (a) la queue pour les transcriptions polyadénylé RNA, seulement les amorces avant doivent être gène spécifique, ainsi, exigeant seulement la connaissance d’une région beaucoup plus petite de l’ARNm. Cela permet l’amplification des régions dont les séquences ne sont pas complètement caractérisé4,7. Cela a permis à 3′ course permettant non seulement de déterminer l’extrémité 3′ d’un gène, mais également déterminer et caractériser les grandes régions en amont du PAS qui forment une partie importante de la région 3′ UTR. En combinant 5′ course avec la mis à jour le 3′ course qui comprend des portions plus importantes de la région 3′ UTR et régions adjacentes, on peut pleinement séquence ou cloner une toute transcription ARNm de l’extrémité 5′ à son extrémité de 3′8.
L’identification récente d’un roman CCND1-MRCK transcription de gène fusion de lignées de cellules de lymphome du manteau et de patients atteints de cancer en est un exemple de cette demande de mis à jour le 3′ RACE. La région 3′ UTR consistait en des séquences de gènes les CCND1 et MRCK et était récalcitrant à miRNA règlement9. Les deux imbriqués CCND1 avant des amorces spécifiques sont complémentaires dans la région immédiatement adjacente et en aval du codon CCND1 . Bien que le séquençage de transcriptome entier ainsi que des outils bioinformatiques spécifique peut être utilisé pour détecter des fusions de gènes au sein de la 3′ UTR10, nombreux laboratoires peuvent n’ont pas les ressources financières ou l’expertise de bioinformatique pour faire usage de cette technologie. 3′ RACE est donc une alternative pour l’identification de novo et la validation des gènes de roman fusion impliquant la région 3′ UTR. Considérant la drastique augmentation du nombre de gènes de fusion signalés ainsi que de lire par l’intermédiaire de transcriptions, 3′ RACE est devenu un outil puissant pour la caractérisation des séquences de gène11,12. En outre, des études récentes ont montré que différentes séquences au sein de la région 3′ UTR ainsi que la longueur de la région 3′ UTR peut affecter mRNA stabilité de transcription, localisation, traduisibilité et fonction13. Due en partie à un intérêt accru dans la cartographie du transcriptome, il y a eu une augmentation du nombre des différents ADN polymérases, en cours d’élaboration pour une utilisation en laboratoire. Il est important de déterminer quels types de modifications peuvent être apportées à la 3′ Protocole de course en afin d’utiliser le répertoire disponible des ADN polymérases.
Ce travail rapports adaptation 3′ course de cartographier l’ensemble 3′ UTR, les FE et 3′ fin site de clivage de la transcription de ANKHD1 à l’aide d’imbriqués amorces au sein de la section ANKHD1 de la transcription et deux différents ADN polymérases.
Protocol
Representative Results
Discussion
Malgré l’avènement des technologies de séquençage parallèle massive, sur une base de gène par gène, 3′ RACE reste la méthode la plus facile et plus économique pour identifier les PAS et les nucléotides adjacents à la queue poly (a). L’adaptation décrite ici développe en utilisant 3′ course à amplifier et carte des séquences qui incluent une partie de l’ORF, le codon d’arrêt et l’entière région 3′ UTR de la transcription ARNm de ANKHD1 . Un avantage majeur de la 3′ RACE est que, avec q…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Bettine Gibbs pour son aide technique.
Materials
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
| Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
| GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
| DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
| Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
| Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
| Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
| 2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
| 10mM dNTP | Amresco | N557 | |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
| Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
| 2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
| PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
| Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
| Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
| Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
| Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
| Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
| Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
| NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
| Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
| Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
| MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
| Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
| Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
| Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |
Riferimenti
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