התאמת 3' הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן

Summary

שני שונים 3′ מהירה הגברה של הקצוות cDNA (3′ מירוץ) פרוטוקולים שתואר כאן הופכים את השימוש של שני polymerases דנ א שונים כדי למפות רצפים הכוללים קטע של מסגרת קריאה פתוחה (ORF) על stop codon, את כולה 3′ UTR של תעתיק באמצעות ה-RNA להשיג שורות תאים סרטן שונים.

Abstract

ההבשלה של mRNAs האיקריוטים כרוך 3′ הקצה למערך, הכוללת התוספת של זנב poly(A). על מנת למפות את קצה 3′ של גנים, השיטה המסורתית להתמקד יש 3′ הגברה מהירה קצות cDNA (3′ גזע). פרוטוקולים עבור 3′ המירוץ דורשים תכנון זהיר ומבחר תחל מקוננים בתוך 3′ האזור לא מתורגם (3′ UTR) של הגן היעד עניין. עם זאת, עם מספר שינויים בפרוטוקול יכול לשמש כדי לכלול את כל 3′ UTR רצפים בתוך מסגרת קריאה פתוחה (ORF), מתן תמונה מקיפה יותר של הקשר בין של ORF את 3′ UTR. זאת, בנוסף זיהוי של הסימן פוליאדנילציה (PAS), כמו גם המחשוף ואתר פוליאדנילציה שסופקו על-ידי קונבנציונלי 3′ המירוץ. המורחב 3′ גזע יכולים לזהות יוצא דופן 3′ UTRs, כולל גנים fusions בטווח 3′ UTR, ואת המידע רצף יכול לשמש כדי לחזות אתרי קישור miRNA פוטנציאליים, כמו גם AU עשיר יציב אלמנטים שעשויים להשפיע על היציבות של התעתיק.

Introduction

היווצרות של הקצה 3′ הוא שלב קריטי ב- mRNA ההבשלה שכוללת את המחשוף של pre-mRNA במורד הזרם של פאס ואחריו התוספת של ~ 250 untemplated adenines, אשר מרכיבים את הזנב poly(A)^1,2. החלבון איגוד poly(A) (PABP) נקשר הזנב poly(A), זה מגן על התעתיק mRNA מפני השפלה, ומקלה על תרגום¹.

הערכות הנוכחי מראים כי 70% של גנים אנושיים יש מסירה מרובים, ובכך עוברים פוליאדנילציה חלופיים, וכתוצאה מכך מספר 3′ קצוות³. לכן, חשוב לזהות איפה הזנב poly(A) מייחסת שארית 3′ UTR, כמו גם לזהות את PAS בשימוש על ידי כל תעתיק נתון. כניסתו של הדור הבא רצפי הביא זיהוי בו זמנית של 3′ UTRs ואת המעבר של אלפי גנים. עלייה זו יכולת רצף דרש הפיתוח של bioinformatic אלגוריתמים לניתוח נתונים מעורבים פוליאדנילציה חלופית של הסוף 3′. עבור זיהוי דה נובו או אימות של מלון פאס, ומכאן מיפוי של 3′ סוף גנים יחידניים מנתונים רצף בקנה מידה גדול, 3′ המירוץ נשאר לשיטת הבחירה^4,5. רצפי הכלולים במוצרי cDNA של 3′ המירוץ בדרך כלל כוללים רק חלק מתוכן 3′ UTR המכיל את הזנב poly(A), האתר המחשוף, מלון פאס, רצפי במעלה הזרם PAS. בניגוד PCR, הדורש שימוש של גן מסוים ואחורה תחל ועיצוב, 3′ המירוץ רק דורש שני גנים ספציפיים מקוננים קדימה תחל. לפיכך, PCR דורש ידע מפורט יותר של הרצף נוקלאוטיד של אזור גדול של הגן להיות מוגבר^4,6. מאז 3′ המירוץ משתמשת אותו הפוך פריימר כי מטרות poly(A) זנב עבור כל התרשימים polyadenylated RNA, רק תחל קדימה צריך להיות גנים ספציפיים, לפיכך, רק הדורשים ידע של אזור הקטנה משמעותית mRNA. פעולה זו מאפשרת ההגברה של אזורים רצפים של מי אינם במלואו מאופיין^4,7. זו אפשרה 3′ גזע כדי לשמש לא רק כדי לקבוע את הקצה 3′ של הגן, אבל גם לקבוע לאפיין אזורים גדולים במעלה הזרם של מלון פאס המהווים חלק ניכר 3′ UTR. על ידי שילוב 5′ המירוץ עם ששונה 3′ המירוץ הכולל חלקים גדולים יותר 3′ UTR ואזורים איגוף, זה אפשרי לחלוטין רצף או לשכפל התעתיק mRNA כולו מקצה 5′ שלה 3′ סוף⁸.

דוגמה של יישום זה של ששונה 3′ המירוץ הוא זיהוי האחרונות רומן CCND1-MRCK פיוז’ן ג’ין תעתיק של שורות תאים לימפומה המעטפת התא, חולי סרטן. 3′ UTR כללה רצף של גנים הן CCND1 והן MRCK , היה הסרבן miRNA תקנה⁹. שני מקוננים CCND1 ספציפי לפנים תחל היו משלימים באזור הסמוך מיידי של הזרם של codon להפסיק CCND1 . למרות transcriptome כל רצף יחד עם כלים bioinformatic ספציפי יכול לשמש כדי לזהות גנים fusions בתוך 3′ UTR¹⁰, מעבדות רבות ייתכן שיחסרו את המשאבים הכספיים או מומחיות bioinformatic לעשות שימוש בטכנולוגיה זו. ומכאן, 3′ המירוץ הוא חלופה עבור דה נובו זיהוי ואימות של פיוז’ן הרומן גנים מעורבים של 3′ UTR. בהתחשב בכך דרסטי להגדיל את מספר גנים פיוז’ן שדווחה וכן לקרוא דרך תעתיקים, 3′ המירוץ הפך להיות כלי רב עוצמה באפיון ג’ין-רצפים-^11,–¹². בנוסף, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שכי רצפים שונים בטווח 3′ UTR, כמו גם את אורך 3′ UTR יכול להשפיע mRNA התעתיק יציבות, לוקליזציה, translatability, הפונקציה¹³. בחלקו בשל עניין מוגבר במיפוי של transcriptome, חלה עלייה במספר polymerases דנ א שונים שפותחו לשימוש במעבדה. חשוב לקבוע מה סוגי שינויים יכולים להתבצע 3′ פרוטוקול המירוץ ב כדי לנצל את הרפרטואר הזמינים של דנ א polymerases.

עבודה זו דוחות התאמה 3′ גזע כדי למפות את כל 3′ UTR, מלון פאס, ואתר 3′ סוף המחשוף של התעתיק ANKHD1 באמצעות מקונן תחל בתוך המקטע ANKHD1 של התעתיק, שני polymerases דנ א שונים.

Protocol

ללבוש חלוק מעבדה, כפפות בטיחות משקפיים בכל עת בזמן ביצוע כל ההליכים ב פרוטוקול זה. ודא כי מכולות/צינורות המכיל הכימית isothiocyanate פנול ו guanidine נפתחים רק מוסמך הוד, ולאחר השלך פסולת פנול במיכל ייעודי. השתמש DNAse/RNAse ללא צינורות סטרילי, טיפים, ריאגנטים. 1. תרבית תאים לגדול הלה תא ?…

Representative Results

חיפוש מקוננים פריימר לפנים: הג’ל agarose מ איור 1 מציג שני ברורים PCR ג’ל מוצרים (מסלולים 1 ו- 2) אשר השתמש אותו קדימה פריימר אלא תחל הפוכה שונים. 3 ליין יש מוצר ה-PCR ברורים ויש פריימר ואחורה ברורים. צבעי בסיס אידיאלי לשימוש עב…

Discussion

למרות הופעתו של טכנולוגיות רצף מקביל מסיבית, על בסיס ג’ין-מאת-גן, 3′ המירוץ נשאר עדיין השיטה הקלה ביותר וחסכוני ביותר לזהות את PAS נוקלאוטידים סמוכים ועד הזנב poly(A). הסתגלות שתוארו כאן מרחיב באמצעות 3′ גזע כדי להגביר והן מפת רצפים הכוללים חלק של ORF על stop codon, את כולה 3′ UTR של תמליל mRNA ANKHD1 . היתרו?…

Materials

HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.