3 ' अनुकूलन सीडीएनए के तेजी से प्रवर्धन के लिए कैंसर में टेप नक्शा समाप्त होता है
Summary
दो अलग 3 सीडीएनए के तेजी से प्रवर्धन (3 ‘ दौड़) प्रोटोकॉल यहां वर्णित दो अलग डीएनए polymerases का उपयोग करने के लिए दृश्य है कि खुले पढ़ने के फ्रेम (ओआरएफ), बंद codon, और एक प्रतिलिपि के पूरे 3 ‘ UTR आरएनए का उपयोग कर एक खंड शामिल नक्शा बनाने अलग कैंसर सेल लाइनों से प्राप्त की ।
Abstract
eukaryotic mRNAs की परिपक्वता 3 ‘ अंत गठन है, जो एक पाली के अलावा शामिल है (एक पूंछ) शामिल है । आदेश में एक जीन के 3 ‘ अंत नक्शा करने के लिए, पसंद की पारंपरिक विधि सीडीएनए समाप्त होता है की ‘ 3 तेजी से प्रवर्धन (3 ‘ दौड़) । 3 ‘ दौड़ के लिए प्रोटोकॉल सावधान डिजाइन और नेस्टेड प्राइमरों के चयन के भीतर 3 ‘ unअनुवादित क्षेत्र (3 ‘ UTR) ब्याज की लक्ष्य जीन की आवश्यकता होती है । हालांकि, कुछ संशोधनों के साथ प्रोटोकॉल के लिए पूरे 3 ‘ UTR और दृश्यों को शामिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है खुले पढ़ने के फ्रेम (ओआरएफ), के बीच संबंधों की एक और व्यापक तस्वीर उपलब्ध कराने के ओआरएफ और 3 ‘ UTR । इस polyadenylation संकेत (क़दम), साथ ही दरार और polyadenylation पारंपरिक 3 ‘ दौड़ द्वारा प्रदान की साइट की पहचान के अलावा है । विस्तारित 3 ‘ दौड़ 3 ‘ UTR के भीतर जीन संलयन सहित असामांय 3 ‘ UTRs, का पता लगाने, और अनुक्रम जानकारी के लिए संभावित miRNA बाध्यकारी साइटों की भविष्यवाणी के रूप में अच्छी तरह के रूप में AU अमीर तत्वों है कि प्रतिलिपि की स्थिरता को प्रभावित कर सकते है इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
3 ‘ के अंत के गठन mRNA परिपक्वता में एक महत्वपूर्ण कदम है कि पूर्व के दरार शामिल है एक के अलावा के बाद एक क़दम के mRNA बहाव ~ 250 unadeninesed, जो पाली (एक) पूंछ1,2। पाली (एक) बंधन प्रोटीन (PABP) पाली (एक) पूंछ को बांध, और यह क्षरण से mRNA प्रतिलिपि की रक्षा करता है, और अनुवाद की सुविधा1।
वर्तमान अनुमान का सुझाव है कि मानव जीन के 70% से अधिक पास है, और इस तरह वैकल्पिक polyadenylation से गुजरना, एकाधिक 3 ‘ में जिसके परिणामस्वरूप ‘ समाप्त होता है3। इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है की पहचान जहां पाली (एक) पूंछ 3 ‘ UTR के आराम करने के लिए देता है, साथ ही साथ किसी भी प्रतिलिपि द्वारा इस्तेमाल किया क़दम की पहचान । अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के आगमन 3 ‘ UTRs और जीन के हजारों की तादात के एक साथ पहचान में हुई है । अनुक्रमण क्षमता में यह वृद्धि 3 ‘ अंत के वैकल्पिक polyadenylation शामिल डेटा का विश्लेषण करने के लिए bioinformatic एल्गोरिदम के विकास की आवश्यकता है. de नोवो पता लगाने या क़दम और इसलिए बड़े पैमाने पर अनुक्रमण डेटा से व्यक्तिगत जीन के 3 ‘ अंत के मानचित्रण के सत्यापन के लिए, 3 ‘ दौड़ विकल्प की विधि बनी हुई है4,5. 3 ‘ दौड़ के सीडीएनए उत्पादों में शामिल अनुक्रम आम तौर पर 3 ‘ UTR है कि पाली (एक) पूंछ, दरार साइट, क़दम, और इस क़दम का जुगाड़ ऊपर शामिल है के केवल एक भाग शामिल हैं । पीसीआर, जो डिजाइन और जीन के उपयोग की आवश्यकता के विपरीत विशिष्ट आगे और रिवर्स प्राइमरों, ‘ 3 रेस केवल दो जीन विशिष्ट नेस्टेड आगे प्राइमरों की आवश्यकता है । इसलिए, पीसीआर4,6प्रवर्धित किया जा रहा जीन के एक बड़े क्षेत्र के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के एक अधिक विस्तृत ज्ञान की आवश्यकता है । 3 ‘ दौड़ के बाद से एक ही रिवर्स प्राइमर है कि लक्ष्य पाली (एक) सभी polyadenylated आरएनए टेप के लिए पूंछ का उपयोग करता है, केवल आगे प्राइमरों जीन विशिष्ट होना चाहिए, इस प्रकार, केवल mRNA के एक काफी छोटे क्षेत्र के ज्ञान की आवश्यकता होती है । यह क्षेत्रों जिसका अनुक्रम पूरी तरह से4,7विशेषता नहीं है के प्रवर्धन सक्षम बनाता है । यह 3 ‘ दौड़ के लिए एक जीन के 3 ‘ अंत निर्धारित करने के लिए ही नहीं इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति दी है, लेकिन यह भी निर्धारित करने के लिए और क़दम है कि 3 ‘ UTR का एक महत्वपूर्ण हिस्सा फार्म के ऊपर बड़े क्षेत्रों की विशेषता । 3 ‘ UTR और पार्श्व क्षेत्रों के बड़े भाग शामिल है कि संशोधित 3 दौड़ के साथ 5 ‘ दौड़ के संयोजन से, यह पूरी तरह से अनुक्रम या 5 ‘ अंत से अपने 3 ‘ अंत तक एक पूरे mRNA प्रतिलिपि क्लोन करने के लिए संभव है8।
संशोधित 3 दौड़ के इस आवेदन का एक उदाहरण है एक उपंयास CCND1-MRCK संलयन मेंटल सेल लिंफोमा सेल लाइनों और कैंसर रोगियों से जीन प्रतिलिपि की हाल ही में पहचान है । 3 ‘ UTR ने मिलकर CCND1 और MRCK जीन दोनों से जुगाड़ किया और miRNA रेगुलेशन9को अड़ियल बना दिया । दो नेस्टेड CCND1 विशिष्ट आगे प्राइमर क्षेत्र के पूरक थे तुरंत आसंन और CCND1 बंद codon के बहाव । हालांकि पूरे transcriptome विशिष्ट bioinformatic उपकरण के साथ अनुक्रमण 3 ‘ UTR10के भीतर जीन संलयन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कई प्रयोगशालाओं वित्तीय संसाधनों या bioinformatic विशेषज्ञता इस तकनीक का उपयोग करने के लिए कमी हो सकती है । इसलिए, 3 ‘ दौड़ de नोवो पहचान और उपंयास संलयन 3 ‘ UTR शामिल जीन के सत्यापन के लिए एक विकल्प है. रिपोर्ट फ्यूजन जीन की संख्या में भारी वृद्धि को ध्यान में रखते हुए के रूप में अच्छी तरह के रूप में टेप के माध्यम से पढ़ें, 3 ‘ दौड़ निस्र्पक जीन अनुक्रम में एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है11,12। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि 3 ‘ UTR के भीतर अलग दृश्यों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 3 ‘ UTR की लंबाई mRNA प्रतिलिपि स्थिरता, स्थानीयकरण, अनुवाद को प्रभावित कर सकते हैं, और समारोह13। transcriptome मानचित्रण में एक वृद्धि की रुचि के हिस्से में कारण, वहां विभिंन डीएनए polymerases की संख्या में वृद्धि की गई है प्रयोगशाला में इस्तेमाल के लिए विकसित किया जा रहा है । यह निर्धारित करने के लिए क्या संशोधनों के प्रकार 3 ‘ रेस प्रोटोकॉल के लिए बनाया जा सकता है ताकि डीएनए polymerases के उपलब्ध प्रदर्शनों की व्यवस्थाओं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
यह काम 3 ‘ दौड़ के लिए पूरे 3 ‘ UTR, क़दम नक्शा, और 3 ‘ के अंत में ANKHD1 प्रतिलिपि के दरार साइट के अनुकूलन की रिपोर्ट की प्रतिलिपि के ANKHD1 खंड के भीतर नेस्टेड प्राइमरों का उपयोग करके और दो अलग डीएनए polymerases ।
Protocol
Representative Results
Discussion
बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के आगमन के बावजूद, एक जीन-दर-जीन आधार पर, 3 ‘ दौड़ अभी भी सबसे आसान और सर्वाधिक किफायती तरीका के लिए क़दम और पाली (ए) पूंछ से सटे न्यूक्लियोटाइड की पहचान बन?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उसे तकनीकी मदद के लिए Bettine गिब्स को स्वीकार करना चाहते हैं ।
Materials
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
| Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
| GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
| DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
| Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
| Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
| Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
| 2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
| 10mM dNTP | Amresco | N557 | |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
| Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
| 2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
| PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
| Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
| Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
| Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
| Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
| Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
| Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
| NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
| Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
| Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
| MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
| Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
| Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
| Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |
Riferimenti
- Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3′ end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
- Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
- Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
- Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
- Bertioli, D., White, B. A. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. 67, 233-238 (1997).
- Freeman, L. A., Freeman, L. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5′ and 3′ RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1027, 3-17 (2013).
- Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
- Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
- Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
- Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3’UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
- International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
- Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
- Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
- Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
- Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
- Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).
