To forskjellige 3′ rask forsterkningen på cDNA ender (3′ RACE) protokoller beskrevet her gjør bruk av to forskjellige DNA polymerases tilordne sekvenser som inkluderer et segment åpent lesing (ORF), stopp codon, og det hele 3′ UTR av en utskrift ved hjelp av RNA Hentet fra ulike kreftcelle linjer.
Modning av eukaryote mRNAs innebærer 3 slutten formasjon, som involverer tillegg av en poly(A) hale. For å tilordne 3 slutten av et gen, er den tradisjonelle metoden valgfrihet 3 raske forsterkning av cDNA ender (3′ RACE). Protokoller for 3′ rase krever forsiktig design og utvalg av nestede primere i 3 uoversatt regionen (3′ UTR) i målet genet av interesse. Men med noen modifikasjoner kan protokollen brukes å inkludere hele 3′ UTR og sekvenser fra åpent lesing rammen (ORF), gir en mer helhetlig bilde av forholdet mellom ORF og de 3′ UTR. Dette er i tillegg til identifikasjonen av polyadenylation (PAS), samt webområdet cleavage og polyadenylation levert av konvensjonelle 3′ rase. Utvidet 3′ rase kanne merker uvanlig 3′ UTRs, inkludert gene fusjoner i de 3′ UTR, og rekkefølgen informasjonen kan brukes til å forutsi mulige miRNA bindende områder samt AU rik destabiliserende elementer som kan påvirke stabiliteten i transkripsjon.
Dannelsen av 3 slutten er en avgjørende skritt i mRNA holdbarhet som består i spalting av det pre-mRNA nedstrøms av en PAS etterfulgt av tillegg av ~ 250 untemplated adenines, som utgjør poly(A) hale1,2. Poly(A) binding protein (PABP) binder til poly(A) halen, og dette beskytter mRNA transkripsjon fra fornedrelse, og forenkler oversettelse1.
Aktuelle anslår foreslå at 70% av menneskets gener har flere PASs, og dermed gjennomgå alternative polyadenylation, som resulterer i flere 3 ender3. Derfor er det viktig å identifisere der poly(A) halen festes til resten av de 3′ UTR, i tillegg til å identifisere PAS brukes av noen gitt transkripsjon. Bruk av neste generasjons sekvensering har resultert i samtidige identifikasjon av 3′ UTRs og PASs av gener. Denne økningen i sekvensering evnen har krevd utvikling av bioinformatic algoritmer å analysere data med alternative polyadenylation 3 slutten. For de novo søket eller validering av PAS og dermed tilordning av 3 slutten av enkelte gener fra storskala sekvensering data, forblir 3′ rase metoden for valg4,5. Sekvenser med i cDNA produkter av 3′ rase vanligvis inkluderer bare en del av de 3′ UTR som inneholder poly(A) halen, webområdet cleavage, PAS og sekvenser oppstrøms av PAS. I motsetning til PCR, som krever design og bruk av genet bestemt forover og bakover grunning, krever 3′ RACE bare to genet bestemt nestede frem primere. Derfor krever PCR mer detaljert kunnskap om nukleotid sekvensen av et stort område av genet blir forsterket4,6. Siden 3′ rase bruker omvendt samme primer at mål poly(A) hale for alle polyadenylated RNA transkripsjoner, bare videresende primerne må være genet spesifikke, dermed kun krever kunnskap om en betydelig mindre region av mRNA. Dette gjør forsterkningen på områder som sekvensene ikke er fullt preget4,7. Dette har tillatt 3′ rase ikke bare å finne 3 slutten av et gen, men å også bestemme og karakterisere store regioner oppstrøms PAS som utgjør en betydelig del av de 3′ UTR. Ved å kombinere 5′ løp med den endrede 3′ rase som inkluderer større deler av de 3′ UTR og flankemanøveren regioner, er det mulig å fullstendig rekkefølge eller klone en hele mRNA utskrift fra 5′ slutten til sin 3 slutten8.
Et eksempel på dette programmet av endrede 3′ rase er siste identifikasjon av en roman CCND1-MRCK fusion genet utskrift fra mantelen celle lymfom cellelinjer og pasienter. De 3′ UTR besto av sekvenser fra både CCND1 og MRCK gener og var motvillig til miRNA regulering9. To nestede CCND1 bestemt frem primerne var komplementær til regionen umiddelbart tilstøtende og nedstrøms CCND1 stopp codon. Selv om hele transcriptome sekvensering med bestemte bioinformatic verktøy kan brukes til å oppdage genet fusjoner i de 3 UTR10, mange laboratorier kan mangle den økonomiske ressurser eller bioinformatic kompetanse til å gjøre bruk av denne teknologien. Derfor er 3′ RACE et alternativ for de novo identifikasjon og validering av romanen fusion gener som involverer den 3′ UTR. Vurderer drastisk økning i antallet rapporterte fusion gener som lese gjennom transkripsjoner, har 3′ rase blitt et kraftig verktøy i karakteriserer genet sekvenser11,12. I tillegg har studier vist at forskjellige sekvenser i de 3′ UTR samt lengden på den 3′ UTR kan påvirke mRNA transkripsjon stabilitet, lokalisering, translatability og funksjonen13. Delvis på grunn av en økt interesse i kartlegging av transcriptome, har det vært en økning i antall forskjellige DNA polymerases utviklet for bruk i laboratoriet. Det er viktig å finne ut hva endringstypene kan gjøres til 3′ rase protokoll i å utnytte det tilgjengelige repertoaret av DNA polymerases.
Dette arbeidet rapporter tilpasse 3′ rase å kartlegge den hele 3′ UTR, PAS og 3 slutten cleavage området av ANKHD1 transkripsjon ved hjelp av nestede primere i delen ANKHD1 transkripsjon og to forskjellige DNA polymerases.
Til tross for bruk av massiv parallelle sekvensering teknologi på gene-av-genet basis, fortsatt 3′ rase den enkleste og mest økonomiske metoden å identifisere PAS og nukleotider tilstøtende poly(A) halen. Tilpasningen beskrevet her utvider bruker 3′ rase både forsterke og tilordne sekvenser som inkluderer en del av ORF, stopp codon og det hele 3′ UTR av ANKHD1 mRNA transkripsjon. En stor fordel med 3′ rase er at med noen mindre tilpasninger, kan produkter fra 3′ rase klones i andre vektorer å lette nedstr?…
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å erkjenne Bettine Gibbs for hennes teknisk hjelp.
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
10mM dNTP | Amresco | N557 | |
RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |