Adaptação 3' rápida amplificação do CDNA termina para mapear transcritos em câncer

Summary

A amplificação rápida dois diferentes 3′ extremidades do cDNA (3′ corrida) protocolos descrito aqui fazem uso de dois diferentes polimerases de DNA para mapear sequências que incluem um segmento de quadro de leitura aberta (ORF), o códon de parada e o inteiro 3′ UTR de uma transcrição de usando o RNA obtidos de linhagens celulares de cancro diferentes.

Abstract

Maturação dos mRNAs eucarióticos envolve 3′ formação de ponta, que envolve a adição de uma cauda poli (a). A fim de mapear a extremidade 3′ de um gene, o tradicional método de escolha é 3′ amplificação rápida das extremidades do cDNA (3′ corrida). Protocolos para 3′ corrida requerem o design cuidadoso e seleção de primers aninhadas dentro da região 3′ untranslated (3′ UTR) do gene alvo de interesse. No entanto, com algumas modificações, o protocolo pode ser usado para incluir o inteiro 3′ UTR e sequências dentro do quadro de leitura aberta (ORF), fornecendo uma imagem mais abrangente da relação entre a ORF e a 3′ UTR. Isto está além da identificação do sinal de poliadenilação (PAS), assim como o decote e poliadenilação site fornecido pelo convencional 3′ corrida. Expandida de 3′ corrida pode detectar incomum 3′ UTRs, incluindo fusões gene dentro a 3′ UTR, e as informações de sequência podem ser usadas para prever potenciais locais obrigatórios de miRNA, bem como AU rico desestabilizando a elementos que possam afectar a estabilidade da transcrição.

Introduction

A formação da extremidade 3′ é um passo crítico na maturação do mRNA que compreende a clivagem do pre-mRNA a jusante de um PAS, seguido pela adição de 250 ~ untemplated adenines, que formam a cauda de poli^1,2. Proteína de ligação a poli (PABP) vincula-se à cauda poli (a), e isso protege a transcrição do mRNA de degradação e facilita a tradução¹.

As estimativas atuais sugerem que 70% dos genes humanos têm Passe múltiplo e, portanto, submeter-se poliadenilação alternativa, resultando em múltiplos 3′ extremidades³. Assim, é importante identificar onde a cauda poli (a) atribui ao resto do 3′ UTR, bem como identificar o PAS usado por qualquer transcrição determinada. O advento da próxima geração de sequenciamento resultou na identificação simultânea de 3′ UTRs e a passagem de milhares de genes. Este aumento na capacidade de sequenciamento exigiu o desenvolvimento de algoritmos de bioinformatic para analisar os dados envolvendo poliadenilação alternativa da extremidade 3′. Para a detecção de novo ou validação do PAS e, portanto, mapeamento da extremidade 3′ de genes individuais de dados de sequenciamento em larga escala, 3′ corrida continua a ser o método de escolha^4,5. As sequências incluídas em produtos de cDNA de 3′ corrida normalmente incluem apenas uma parte do 3′ UTR que contém a cauda poli (a), o local de clivagem, o PAS, sequências e o montante do PAS. Ao contrário do PCR, que requer a concepção e utilização do gene específico para diante e reverso primeiras demão, 3′ corrida requer apenas duas gene específico aninhado frente primeiras demão. Daí, a PCR requer um conhecimento mais detalhado da sequência de nucleotídeos de uma grande região do gene sendo amplificado^4,6. Desde 3′ corrida usa o mesmo inverter a primeira demão que metas a poli (a) cauda para todos polyadenylated RNA transcritos, somente os primers para a frente devem ser gene específico, assim, exigindo apenas conhecimento de uma região significativamente menor do mRNA. Isso permite que a amplificação das regiões cujas sequências não são inteiramente caracterizado^4,7. Isto permitiu 3′ corrida para ser usado não somente para determinar a extremidade 3′ de um gene, mas para também determinar e caracterizar regiões grandes montante do PAS que formam uma parcela significativa de 3′ UTR. Combinando 5′ corrida com o modificado 3′ corrida que inclui porções maiores de 3′ UTR e flanqueiam regiões, é possível totalmente sequenciar ou clonar uma transcrição de mRNA inteira da extremidade 5′ para seus 3′ final⁸.

Um exemplo desta aplicação de modificado 3′ corrida é a identificação recente de um romance CCND1-MRCK transcrição de gene de fusão de linhas de células do linfoma de células do manto e pacientes com câncer. O 3′ UTR consistia de sequências de genes de ambos os CCND1 e MRCK e foi recalcitrantes a miRNA Regulamento⁹. Os dois aninhados CCND1 específicos frente primers foram complementares à região imediatamente adjacente e a jusante do CCND1 códon de parada. Embora toda transcriptoma sequenciamento juntamente com ferramentas de bioinformatic específico pode ser usado para detectar fusões gene dentro do 3′ UTR¹⁰, muitos laboratórios podem não ter os recursos financeiros ou bioinformatic perícia para fazer uso desta tecnologia. Portanto, 3′ corrida é uma alternativa para novo de identificação e validação de genes de fusão novela envolvendo a 3′ UTR. Considerando o drástico aumento no número de genes de fusão relatados, bem como ler as transcrições, 3′ corrida tornou-se uma poderosa ferramenta na caracterização de gene sequências^11,12. Além disso, estudos recentes demonstraram que diferentes sequências dentro a 3′ UTR, bem como o comprimento de 3′ UTR pode afetar a estabilidade de transcrição do mRNA, localização, Traduzibilidade próprios e função¹³. Devido em parte ao crescente interesse no mapeamento da transcriptoma, tem havido um aumento no número de diferentes polimerases de DNA, sendo desenvolvido para uso em laboratório. É importante determinar que tipos de modificações podem ser feitos para o 3′ protocolo de corrida em a fim de utilizar o repertório disponível de polimerases de DNA.

Este trabalho de adaptação 3′ corrida para mapear o inteiro 3′ UTR de relatórios, o PAS e 3′ final local de clivagem da transcrição de ANKHD1 usando aninhados cartilhas dentro da seção de ANKHD1 de transcrição e dois diferentes polimerases de DNA.

Protocol

Vestir um jaleco, luvas e óculos de segurança em todos os momentos durante a execução de todos os procedimentos no presente protocolo. Certifique-se que recipientes/tubos contendo o reagente de isotiocianato de fenol e guanidina só são abertos em um capuz certificada e descarte de resíduos de fenol em um recipiente designado. Use os reagentes, dicas e tubos estéreis DNAse/RNAse-livre. 1. cultura de pilha Crescer a linhagem de células HeLa e dois suspensão manto linfoma cél…

Representative Results

Pesquisa de Primer frente aninhados: O gel de agarose de A Figura 1 mostra dois produtos distintos de gel PCR (faixas 1 e 2) que uso o mesmo encaminhar a cartilha mas diferentes cartilhas reversos. 3 Lane tem um produto PCR distinto e tem uma distinta cartilha frente e verso. Os primers ideais para usar para a reação de PCR com base são aqueles que dão um produto PCR distinto (faix…

Discussion

Apesar do advento das tecnologias de sequenciação paralelo maciço, numa base de gene-gene-por, 3′ corrida continua a ser o método mais fácil e mais econômico para identificar o PAS e nucleotídeos adjacentes à cauda poli (a). A adaptação descrita aqui expande usando 3′ corrida para amplificar e mapear sequências que incluem uma parte da ORF, o códon de parada e o inteiro 3′ UTR a transcrição do mRNA de ANKHD1 . Uma grande vantagem do 3′ corrida é que, com algumas adaptações menores, produtos de 3…

Materials

HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.