Adaptación de 3' amplificación rápida del CDNA termina para asignar las transcripciones en el cáncer
Summary
La dos diferentes 3′ amplificación rápida del cDNA extremos (3′ RACE) protocolos descrito aquí hacen uso de dos diferentes polimerasas de la DNA para asignar las secuencias que incluyen un segmento del marco de lectura abierto (ORF), el codón de parada y el entero 3′ UTR de una transcripción utilizando RNA obtenidos de líneas celulares de cáncer diferentes.
Abstract
Maduración de los mRNAs eucarióticos consiste en 3′ final de formación, que consiste en la adición de una cola de poly(A). Para asignar el extremo 3′ de un gen, el método tradicional de elección es 3′ amplificación rápida del cDNA extremos (3′ RACE). Protocolos para 3′ raza requieren el cuidado diseño y selección de primers anidados dentro de la región 3′ no traducida (3′ UTR) del gen Diana de interés. Sin embargo, con algunas modificaciones, el protocolo puede utilizarse para incluir el entero 3′ UTR y secuencias dentro del marco de lectura abierto (ORF), proporcionando una visión más comprensiva de la relación entre el ORF y el 3′ UTR. Se trata además de identificación de la señal de poliadenilación (PAS), así como el escote y poliadenilación sitio provisto por convencional 3′ RACE. Ampliado 3′ RACE puede detectar inusual 3′ UTRs, incluyendo fusiones de genes dentro de los 3′ UTR, y la información de secuencia puede utilizarse para predecir potenciales sitios de unión de miRNA como AU rica desestabilizar elementos que puedan afectar la estabilidad de la transcripción.
Introduction
La formación del extremo 3′ es un paso crítico en la maduración del ARNm que comprende el clivaje del pre-mRNA aguas abajo de un paso seguido por la adición de 250 untemplated adenines, que forman parte de la cola de poly(A)1,2. La proteína poly(A) (PABP) se une a la cola de poly(A), y este protege la transcripción del mRNA de la degradación y facilita la traducción1.
Las estimaciones actuales sugieren que el 70% de genes humanos tiene PASs múltiples y así experimentar la poliadenilación alternativa, resultando en múltiples 3′ extremos3. Por lo tanto, es importante identificar donde la cola de poly(A) se fija al resto de los 3′ UTR, así como identificar el PAS utilizado por cualquier transcripción dada. El advenimiento de la secuenciación de próxima generación ha dado como resultado la identificación simultánea de 3′ UTRs y el paso de miles de genes. Este aumento en la capacidad de secuenciación ha requerido el desarrollo de algoritmos bioinformáticos para analizar los datos que implica alternativa poliadenilación del extremo 3′. Para la detección de novo o validación del PAS y por lo tanto, mapeo del extremo 3′ de los genes individuales de datos de secuenciación a gran escala, 3′ carrera sigue siendo el método de elección4,5. Las secuencias incluidas en productos de cDNA de 3′ raza normalmente incluyen sólo una parte de los 3′ UTR que contiene la cola de poly(A), el sitio de la hendidura, el PAS y las secuencias aguas arriba del PAS. A diferencia de la polimerización en cadena, que requiere el diseño y uso de iniciadores específicos de avance y retroceso de gen, 3′ RACE sólo requiere iniciadores adelante anidados específicos de dos genes. Por lo tanto, la PCR requiere un conocimiento más detallado de la secuencia de nucleótidos de una región grande del gen está amplificado4,6. 3′ carrera utiliza el mismo invertir cartilla que metas la poly(A) de la cola para todos contra RNA transcripciones, sólo los iniciadores hacia adelantados tienen que ser gene específico, así, que solo requieren conocimiento de una región significativamente menor del mRNA. Esto permite la amplificación de regiones cuyas secuencias no están completamente caracterizadas4,7. Esto ha permitido 3′ carrera a utilizarse no sólo para determinar el extremo 3′ de un gen, sino para también determinar y caracterizar grandes regiones corriente arriba del PAS que forman una parte importante de los 3′ UTR. Al combinar la carrera con el modificado 3′ carrera que incluye grandes porciones de 3′ UTR y regiones flanqueantes 5′, es posible totalmente la secuencia o clonar una toda transcripción de mRNA del extremo 5′ a sus 3′ extremo8.
Un ejemplo de esta aplicación del modificado 3′ RACE es la reciente identificación de una novela CCND1 MRCK transcripción del gene de fusión de líneas de células del manto linfoma y pacientes con cáncer. El 3′ UTR consistió en secuencias de genes CCND1 y de MRCK y era recalcitrante a miRNA Reglamento9. Los dos anidados CCND1 específicos hacia adelante fueron complementarias a la región inmediatamente adyacente y aguas abajo del codón de parada CCND1 . Aunque transcriptoma toda la secuencia junto con herramientas bioinformáticas específico se puede utilizar para detectar fusiones de genes dentro de los 3′ UTR10, muchos laboratorios pueden carecer los recursos financieros o conocimientos de bioinformática para hacer uso de esta tecnología. Por lo tanto, 3′ RACE es una alternativa para novo de identificación y validación de genes de fusión novedosa que implica el 3′ UTR. Teniendo en cuenta el drástico aumento del número de genes de fusión reportado como Lee las transcripciones, 3′ RACE se ha convertido en una poderosa herramienta en la caracterización de secuencias de genes11,12. Además, estudios recientes han demostrado que diferentes secuencias dentro de los 3′ UTR como la longitud de los 3′ UTR puede afectar estabilidad transcripción ARNm, localización, traducción y función13. Debido en parte a un creciente interés en la cartografía el transcriptoma, ha habido un aumento en el número de diferentes polimerasas de la DNA ser desarrollado para su uso en el laboratorio. Es importante determinar qué tipos de modificaciones pueden hacerse a los 3′ protocolo de la raza en el fin de utilizar el repertorio disponible de polimerasas de la DNA.
Este trabajo informes de adaptación de raza para asignar los enteros 3′ UTR 3′, el PAS y el 3′ final sitio de la hendidura de la transcripción de ANKHD1 utilizando anidados primers dentro de la sección ANKHD1 de la transcripción y dos diferentes polimerasas de la DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar del advenimiento de las tecnologías de secuenciación masiva en paralelo, sobre una base de gen por gen, 3′ carrera sigue siendo el método más fácil y más económico para identificar la PAS y nucleótidos adyacentes a la cola de poly(A). La adaptación descrita aquí expande utilizando 3′ carrera a amplificar tanto mapa secuencias que incluyen una porción del ORF, el codón de parada y el entero 3′ UTR de la transcripción del mRNA de ANKHD1 . Una ventaja de 3′ RACE es que con algunas adaptaciones …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer a Bettine Gibbs por su ayuda técnica.
Materials
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
| Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
| GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
| DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
| Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
| Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
| Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
| 2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
| 10mM dNTP | Amresco | N557 | |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
| Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
| 2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
| PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
| Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
| Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
| Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
| Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
| Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
| Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
| NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
| Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
| Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
| MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
| Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
| Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
| Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |
Riferimenti
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