植物の効率的な方法で複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現
Summary
従来の方法の難しさを克服するために植物の複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現手法を開発しました。タンパク質の共発現を達成するためにカセットを表現する複数の機能的に独立して蛋白質を含んでいる単一発現プラスミドを使用する利点がかかります。
Abstract
蛋白質の時空間的細胞内 localization(s) については、細胞の生理機能を理解する重要です。蛍光タンパク質と蛍光融合タンパク質の生成は、乱暴に直接タンパク質の局在と細胞のダイナミクスを可視化する効果的なツールとして使用されています。それは興味の蛋白質と共発現後よく知られている細胞小器官のマーカーとの比較に便利です。それにもかかわらず、植物タンパク質の共発現の古典的手法は、通常、複数の独立した発現プラスミドを含む、したがって低共発現効率、発現レベルの変動、高時間などの欠点があります。遺伝学的交差およびスクリーニングの支出。本研究では堅牢で新しい植物の複数のキメラ蛍光タンパク質の共発現法について述べる。それは、複数の半独立した表現するカセットから成る単一発現ベクターを用いた従来の方法の限界を克服します。各蛋白質発現カセット、独自の機能性蛋白質の表現の要素を含み、したがってそれ柔軟に調整できる多様な表現の需要を満たすために。また、それは簡単なアセンブリを実行して追加消化と結紮手順なし最適化されたワンステップ反応を用いた発現プラスミドの DNA の操作の断片します。さらに、現在の由来の蛍光タンパク質バイオ イメージング技術やフレットなど BiFC のアプリケーションと完全に互換性が。メソッドの検証としては、蛍光融合共同エクスプレス空胞並べ替え受容体と分泌キャリア膜タンパク質にこの新しいシステムを採用しました。結果は、その視点細胞内局在化が一過性発現と形質転換植物における先行研究と同じであることを示します。
Introduction
キメラ蛍光融合タンパク質は、細胞内動態と細胞内局在を勉強し、さらに生理機能や作業のメカニズム1,2,を理解する役に立つツールとみなされています。3,4. 共同エクスプレスよく知られているオルガネラ レポーター蛋白質蛋白質の良い時空間理論的根拠、配布、およびセル4内システム内の機能を説明するために問題の特に有益です。,5,6,7,8。
キメラの蛍光融合蛋白質は、それぞれ長所と制限9,10,11を持っている植物を介して一過性発現と安定な形質転換で表現できます。タンパク質の一過性発現が含まれています biolistic の衝突-、ポリエチレング リコール (PEG) 便利なアプローチ-、またはプロトプ ラストとアグロバクテリウムのエレクトロポレーションによる DNA 一過性発現-葉浸潤を介したそのまま植物の細胞、図 1 a、B12,13,14,15,16に示すように。ただし、単一植物細胞における複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現にはいくつかの独立した発現プラスミドの混合物が必要です。したがって、植物の共発現用の複数のプラスミドを用いたの欠点は、同時に単一のプラスミドと比較した場合の同じセルに入るいくつかのプラスミドの劇的に減らされたチャンスのため下位の共発現レベルとセル17,18に転送されているプラスミドのそれぞれのタイプの手に負えないほどランダムな量によって引き起こされる蛋白質発現レベルの変動。さらに、タンパク質の共発現9,10,11の単一アグロバクテリウムにいくつかの独立した発現プラスミドを導入する技術的に困難です。したがって、アグロバクテリウム–図 1 bに示すように、葉たばこの含浸による一過性発現を介したタンパク質は、一度に 1 つのプラスミドを表現できるのみ。対照的に、蛍光融合蛋白質を表現する遺伝子組換え植物の世代は、バイナリ変換ベクトルを運ぶアグロバクテリウムによって行われます通常。ただし、遺伝子導入および植物ゲノムへの挿入を仲介するバイナリのベクトルだけ単一蛍光融合タンパク質 (図 1 b)9,10,12を表現することが可能です。いくつかのキメラ蛍光タンパク質を同時に表現する遺伝子組換え植物を生成すると、複数回の遺伝的交差と共発現する遺伝子の数に応じて年ヶ月から取ることができるスクリーニングが必要です。
共同工場で複数のタンパク質発現の単一発現ベクターは、以前のいくつかによって報告されている雇用研究19,20,21です。ただし、複数回の酵素の消化力と DNA 分子とバックボーンのベクトルの DNA の ligation が通常必要タンパク質の共発現または過剰発現の最終的なプラスミッドの生成です。ここでは、共同植物における複数のキメラ蛍光蛋白質を表現するための新しい堅牢な方法を開発しました。両方の一過性発現のための植物で複数タンパク質の共発現と昔ながらの方法で安定した変換を実現する非常に効率的かつ便利な方法です。共発現用複数の機能的に独立してタンパク質発現カセットを含み、従来法の欠点を克服することにより 1 つのベクトルを採用しています。また、どの DNA DNA 消化と結紮の余分な手順なしに最適化された簡単なワンステップ反応により操作とアセンブリを実現します。 汎用性の高いシステムです。動作原理を図 2に示します。さらに、キメラの蛍光融合蛋白質に基づいている現在の細胞、分子および生化学的なアプローチと完全に互換性が。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでしっかり共同植物におけるキメラ蛍光融合蛋白質を表現する手法を説明してきました。一過性発現と形質転換の両方に使用できる、現在蛍光タンパク質ベース バイオ イメージング、分子および生化学的なアプリケーションおよびテクノロジー9,10,13 との互換性.さらに、タンパク質の共発現にいくつかの個々 の発現…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちの役に立つ議論やコメント王研究室のメンバーに感謝します。この作品は h. w. に、国家自然科学基金、中国の (NSFC、グラント号 31570001) と自然科学財団の広東省と広州市 (第 2016A030313401 と 201707010024 を付与) でサポートされて
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
Riferimenti
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