Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante

Xiaomin Peng; Guitao Zhong; Hao Wang

doi:10.3791/57354

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Articolo metodologico

Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante

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DOI:

10.3791/57354

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1 luglio 2018

Xiaomin Peng^*¹ , Guitao Zhong^*¹ , Hao Wang¹

¹College of Life Sciences, South China Agricultural University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per cheesprimono più proteine di fusione fluorescenti chimerico in piante per superare le difficoltà dei metodi convenzionali. Essa si avvale dell'utilizzo di un plasmide di espressione singola che contiene più proteine funzionalmente indipendente esprimendo cassette per ottenere co-espressione della proteina.

Abstract

Informazioni sulla localization(s) spatiotemporal subcellulare di una proteina sono fondamentale per capire le sue funzioni fisiologiche nelle cellule. Proteine fluorescenti e generazione delle proteine di fusione fluorescenti sono stati selvaggiamente utilizzati come strumento efficace per visualizzare direttamente la localizzazione della proteina e la dinamica in cellule. È particolarmente utile per confrontarli con gli indicatori ben noto organello dopo co-espressione con la proteina di interesse. Tuttavia, approcci classici per la co-espressione della proteina nelle piante solitamente coinvolgono più plasmidi di espressione indipendente e quindi hanno svantaggi che includono tempo alta efficienza bassa co-espressione e variazione del livello di espressione dispendio in genetica crossing e di screening. In questo studio, descriviamo un metodo robusto e romanzo per la co-espressione di più proteine chimeriche fluorescenti nelle piante. Presenta le limitazioni dei metodi convenzionali utilizzando un vettore di espressione singola che è composto di più cassette di espressione semi-indipendente. Ogni cassetta di espressione della proteina contiene i propri elementi di espressione funzionale della proteina, e pertanto può essere regolato in modo flessibile per soddisfare la domanda di espressione diversi. Inoltre, è facile e conveniente per eseguire l'assembly e manipolazione del DNA frammenti nel plasmide di espressione utilizzando una reazione ottimizzata One-Step senza ulteriore digestione e passi di legatura. Inoltre, è pienamente compatibile con le attuali tecnologie di bio-imaging fluorescente proteine derivate e applicazioni, ad esempio FRET e BiFC. Come una convalida del metodo, abbiamo impiegato questo nuovo sistema a co-express fluorescente fusa vacuolar ordinamento recettore e proteine di membrana del trasportatore secretiva. I risultati mostrano che la sua localizzazione subcellulare di prospettiva sono gli stessi come in precedenti studi di espressione transitoria sia trasformazione genetica nelle piante.

Introduzione

Proteine chimeriche fluorescenti fusione sono stati considerati come strumenti utili per studiare dinamiche intracellulare e della localizzazione subcellulare e comprendere ulteriormente le loro funzioni fisiologiche e lavoro meccanismi¹^,²^, ³ ^, ⁴. è particolarmente utile per proteine di reporter ben noto organello co-express con la proteina in questione per illustrare meglio il suo spatiotemporal rationale, distribuzione e funzioni all'interno del sistema di endomembrane in cellule⁴ ^, ⁵