La expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescente de manera eficiente en las plantas
Summary
Hemos desarrollado un novedoso método para expresar conjuntamente múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas a superar las dificultades de los métodos convencionales. Toma ventaja del uso de un plásmido de expresión única que contiene múltiples proteínas funcionalmente independiente expresando cassettes para lograr la expresión de la proteína.
Abstract
Información sobre la localization(s) espacio-temporal subcelular de una proteína es fundamental para comprender sus funciones fisiológicas en las células. Proteínas fluorescentes y la generación de proteínas fluorescentes de fusión se han utilizado violentamente como una herramienta eficaz para visualizar directamente la localización de proteínas y la dinámica en las células. Es especialmente útil para compararlos con los marcadores de organelo conocido después de coexpresión con la proteína de interés. Sin embargo, métodos clásicos para la expresión de la proteína en las plantas implican generalmente múltiples plásmidos de expresión independiente y por lo tanto tienen inconvenientes que incluyen eficacia baja expresión Co, variación del nivel de expresión y alto tiempo de gasto en cruce genético y cribado. En este estudio, describimos un método robusto y novedoso para la expresión de múltiples proteínas quiméricas fluorescentes en las plantas. Supera las limitaciones de los métodos convencionales mediante el uso de un vector de expresión individual que se compone de múltiples cintas expresando semi-independiente. Cada cassette de expresión de la proteína contiene sus propios elementos de expresión de la proteína funcional, y por lo tanto se puede ajustar fexiblemente para satisfacer la demanda de expresión diversa. Además, es fácil y conveniente para llevar a cabo la Asamblea y fragmentos de manipulación del ADN en el plásmido de expresión mediante el uso de una reacción de un paso optimizado sin digestión adicional y pasos de ligadura. Además, es totalmente compatible con proteína fluorescente derivada bio-proyección de imagen de las tecnologías actuales y las aplicaciones, como el traste y centro. Como una validación del método, se empleó este nuevo sistema vacuolar receptor clasificación express Co fluorescente fundido y proteínas en la membrana secretora portador. Los resultados muestran que sus localizaciones subcelulares de la perspectiva al igual que en anteriores estudios de expresión transitoria y transformación genética en plantas.
Introduction
Proteínas de fusión fluorescente quimérico se han mirado como herramientas útiles para estudiar la dinámica intracelular y localización subcelular y entiendo sus funciones fisiológicas y trabajo mecanismos1,2, 3 , 4. es especialmente beneficioso para express Co organelo conocido reportero las proteínas con la proteína en cuestión para mejor ilustrar su razonamiento espacio-temporal, distribución y funciones dentro del Sistema endomembranoso de células4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Una proteína quimérica fusión fluorescente se puede expresar en las plantas a través de la expresión transitoria y transformación genética estable, que tienen sus respectivas ventajas y limitaciones9,10,11. La expresión transitoria de una proteína es un método conveniente que incluye biolística bombardeo-, glicol de polietileno (clavija)-, o la expresión transitoria de ADN mediada por electroporación de protoplastos y Agrobacterium-mediada por infiltración de la hoja en células vegetales intactas, tal como se muestra en la figura 1A, B12,13,14,15,16. Sin embargo, coexpresión múltiples quiméricos fluorescentes de proteínas de fusión en una célula de la planta solo requiere una mezcla de varios plásmidos de expresión independiente. Así, las desventajas de emplear múltiples plásmidos para la expresión de la proteína en las plantas son niveles más bajos de la expresión debido a la posibilidad dramáticamente reducido de varios plásmidos entrar simultáneamente en las mismas células en comparación con un solo plásmido y la variaciones de niveles de expresión de la proteína causadas por la cantidad incontrolable al azar de cada tipo de plásmido se transfiere a la célula17,18. Además, es un desafío técnico para introducir varios plásmidos de expresión independiente de una sola Agrobacterium para proteína coexpresión9,10,11. Por lo tanto, Agrobacterium-mediada proteína expresión transitoria por la infiltración de tabaco deja sólo es capaz de expresar un plásmido a la vez, como se muestra en la figura 1B. En cambio, generación de plantas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes de fusión se logra por Agrobacterium que lleva un vector de transformación binaria. Sin embargo, el vector binario que media la transferencia de genes y la inserción en el genoma de la planta sólo es capaz de expresar una sola fusión fluorescente proteína (figura 1B)9,10,12. Generación de una planta transgénica que expresa simultáneamente varias proteínas fluorescentes quiméricas requiere múltiples rondas de cruce genético y proyección, que puede tomar de meses a años dependiendo de los números de los genes que expresa conjuntamente.
El empleo de que un vector de expresión solo para co expresión de varias proteínas en planta ha sido reportado por varios anteriores estudios19,20,21. Sin embargo, múltiples rondas de digestión enzimática y la ligadura de la DNA de las moléculas de ADN y vectores de la columna vertebral deben generalmente para generación del plásmido final de coexpresión de la proteína o expresión. Aquí, hemos desarrollado un método nuevo y robusto para co expresando múltiples proteínas quiméricas fluorescentes en plantas. Es un método altamente eficaz y práctico que alcanza múltiples coexpresión de la proteína en las plantas para la expresión transitoria tanto y la transformación estable de manera tradicional. Emplea un único vector que contiene varios cassettes de expresión proteína funcionalmente independiente para la expresión de la proteína y así supera los inconvenientes de los métodos convencionales. Por otra parte, es un sistema muy versátil en que ADN manipulación y montaje se logran mediante una reacción en un paso simple optimizado sin pasos adicionales de digestión de DNA y la ligadura. El principio de funcionamiento se ilustra en la figura 2. Además, es totalmente compatible con el actuales enfoques celulares, moleculares y bioquímicos que están basados en proteínas de fusión quimérica de fluorescente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí hemos demostrado un nuevo método para robusta Co expresar proteínas quiméricas fluorescentes fusión en plantas. Puede utilizar para la expresión transitoria y transformación genética y es compatible con actuales fluorescentes basados en proteína bio-proyección de imagen molecular y bioquímica aplicaciones y tecnologías9,10,13 . Además, supera las dificultades de los métodos convencionales que utilizan varios p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Wang de las discusiones útiles y comentarios. Este trabajo es apoyado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China (NSFC, grant no. 31570001) y la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Guangdong y la ciudad de Guangzhou (concesión 201707010024 y Nº 2016A030313401) a H.W.
Materials
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
Riferimenti
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