Byggingen av syntetisk Phage vises Fab biblioteket med skreddersydd mangfold
Summary
Denne protokollen beskriver en detaljert fremgangsmåte for bygging av en phage vises syntetiske antistoffer biblioteket med skreddersydd mangfold. Syntetisk antistoffer har bred programmer fra grunnforskning sykdom diagnostikk og therapeutics.
Abstract
Etterspørselen etter monoklonale antistoffer (mAbs) i grunnleggende forskning og medisin øker årlig. Hybridoma teknologi har vært dominerende metoden for mAb utvikling siden sin første rapport i 1975. Som et alternativ teknologi er phage visningsmetoder for mAb utvikling stadig mer attraktivt siden Humira, første phage-avledet antistoffer og en av de bestselgende mAbs, ble godkjent for klinisk behandling av revmatoid artritt i 2002. Som en ikke-dyr basert mAb programvareutvikling teknologi, forbigår phage visning antigen immunogenisitet, menneskeliggjøring og dyr vedlikehold som kreves fra tradisjonell hybridoma teknologi basert antistoff utvikling. I denne protokollen beskriver vi en metode for bygging av syntetisk phage vises Fab biblioteker med forskjeller av 109-1010 oppnåelig med en enkelt electroporation. Denne protokollen består av: 1) høy effektivitet electro-kompetent celle forberedelse; 2) utvinning av uracil inneholder én-strandet DNA (dU-ssDNA); 3) Kunkels metode basert oligonucleotide-rettet mutagenese; 4) electroporation og beregning av biblioteket størrelse; 5) protein A/L-baserte enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) for folding og funksjonell mangfold evaluering; og 6) DNA sekvens analyse av mangfold.
Introduction
mAbs har bred programmer alt fra grunnleggende forskning til sykdom diagnostikk og therapeutics. I 2016, er mer enn 60 mAbs godkjent av USA Food and Drug Administration (USFDA) for klinisk behandling av autoimmune sykdommer, kreft og infeksjonssykdommer1,2.
I 1975 rapportert Kohler og Milstein en teknikk for kontinuerlig generasjon av antistoffer av en enkelt klonal spesifisitet fra en mobil kilde refereres til som “hybridomas” og denne teknikken har blitt en hjørnestein i medisin og industri3 ,4. Generering av mAbs av denne metoden krever ulike trinn inkludert antigen produksjon, musen immunisering, utvinning av B-lymfocytter, blanding av B-celler med myelom celler å danne udødelig hybridoma celler, klone utvalg, og terapeutiske programmer, menneskeliggjøring er nødvendig for å unngå menneskelig anti-musen antistoff (HAMA)4,5. Men for denne teknologien er antigener inkludert giftstoffer, patogener og høyt konservert proteiner relativt ineffektiv utløse en i vivo immunrespons mAb produksjon5.
I 1978 rapportert Hutchison et al. bruk av en oligonucleotide til direkte mutagenese av en rest i en enkelt-strandet bacteriophage virus6. I 1985 rapportert Smith at utenlandske genet fragmenter kan være smeltet i rammen med genet koding phage pels protein III og kan dermed vises på phage overflaten uten akkord dens infectivity7. Dette banebrytende works lagt et grunnlag for påfølgende bygging av phage vises antistoff biblioteker i immunforsvar, naiv og syntetisk danner med formatene av enkelt-kjeden variabel fragment (scFv) og antigen bindende fragment (Fab) for terapeutisk mAb utvikling8,9. Fra teknisk synspunkt, phage skjerm-baserte antistoff utvikling tilbyr en utfyllende tilnærming til hybridoma-baserte mAb utvikling som kan bidra til å omgå begrensningene noen antigener kan utgjøre og menneskeliggjøring prosess som hybridoma-avledet antistoffer krever ofte5. I 2016, 6 phage skjerm-avledet mAbs er godkjent i markedet inkludert Humira, en av de mest vellykkede mAbs brukes for behandling av revmatoid artritt, og mange phage skjerm-avledet antistoff kandidater er på ulike stadier av klinisk etterforskningen10.
For immunforsvaret og naiv phage antistoff biblioteker og mangfoldet av komplementaritet-bestemme regioner (CDRs) i lette og tunge kjede er avledet fra det naturlige immun repertoaret (dvs.fra B celler). I kontrast er mangfoldet av CDRs i syntetisk phage antistoff biblioteker helt kunstig. Syntetisk tilnærminger til biblioteket konstruksjon gir deg presis kontroll over utformingen av variasjonen og tilbyr muligheter for mekanistisk studier av antistoff struktur og funksjon11,12. Videre kan rammeverket for syntetiske biblioteker optimaliseres før biblioteket bygging å lette nedstrøms, større industriell utvikling11,12.
I 1985 Kunkel rapportert en enkelt-strandet DNA (ssDNA) mal-basert mutagenese tilnærming å innføre nettstedet-rettet mutasjoner i M13 bacteriophage effektivt13. Denne tilnærmingen ble senere brukt mye for bygging av phage vises biblioteker. Kjemisk syntetisert DNA oligonucleotides utformet for å innføre mangfold i Fab CDRs er innlemmet i en phagemid med et antistoff ryggraden mal. I denne prosessen, phagemid uttrykkes som en uracil som inneholder ssDNA (dU-ssDNA) og oligonucleotides er herdet til CDRs og utvidet til å syntetisere double-strandet DNA (dsDNA) i nærvær av T7 DNA utvalg og T4 DNA ligase. Til slutt, genererte ds-DNA kan bli introdusert i Escherichia coli av electroporation.
For høy diversitet, phage vises biblioteket konstruksjon, høy spenning electroporation av en to-komponent blanding av elektro-kompetent celler og covalently bør lukket sirkulær dsDNA (CCC-dsDNA) være forberedt nøye. Sidhu et al. endret utarbeidelse av elektro-kompetent celler og DNA fra tradisjonelle metoder og sterkt forbedret biblioteket mangfold14.
I denne protokollen beskriver vi en metode for bygging av syntetisk phage vises Fab biblioteker med forskjeller av 109-1010 oppnåelig med en enkelt electroporation. Figur 1 viser en oversikt over biblioteket bygging inkludert: 1) høy effektivitet electro-kompetent celle forberedelse; 2) utvinning av dU-ssDNA; 3) Kunkels metode basert oligonucleotide-rettet mutagenese; 4) electroporation og beregning av biblioteket størrelse; 5) protein A/L-baserte ELISA for folding og funksjonell mangfold evaluering; og 6) DNA sekvens analyse av mangfold. Alle reagenser, stammer og utstyr er oppført i materialet tabell. Tabell 1 viser reagens oppsettet.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å konstruere høy diversitet, phage vises Fab biblioteker, kvalitetskontroll er sjekk poeng nødvendig for å overvåke forskjellige stadier i byggeprosessen, inkludert kompetansen til elektro-kompetent celler, kvaliteten på malen dU-ssDNA, effektiviteten av CCC-dsDNA syntese, titer etter electroporation, Fab bretting og aminosyre mangfoldet av CDRs av sekvens analyse av Fab-phage kloner.
Høy kapasitet og renhet av dU-ssDNA er viktig for høy mutagenese rente. I vår erfaring, kan phage…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Frederic Fellouse fra Sidhu lab for kritiske kommentarer Kunkels metode basert syntetisk Fab phage biblioteket konstruksjon. Forfatterne takker fru Alevtina Pavlenco og andre medlemmer fra Sidhu lab for verdifull hjelp forberede høyeffektive electro-kompetent E. coli celler og høy kvalitet dU-ssDNA. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant No.: 81572698, 31771006) til DW og ved ShanghaiTech University (Grant No.: F-0301-13-005) til laboratoriet av antistoff Engineering.
Materials
| Reagents | |||
| 1.0 M H3PO4 | Fisher | AC29570 | |
| 1.0 M Tris, pH 8.0 | Invitrogen | 15568-025 | |
| 10 mM ATP | Invitrogen | 18330-019 | |
| 100 mM dithiothreitol | Fisher | BP172 | |
| 100 mM dNTP mix | GE Healthcare | 28-4065-60 | solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-76-02 | |
| 50X TAE | Invitrogen | 24710030 | |
| Agarose | Fisher | BP160 | |
| Carbenicillin, carb | Sigma | C1389 | 100 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL. |
| Chloramphenicol, cmp | Sigma | C0378 | 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9620G | |
| Granulated agar | VWR | J637-500G | |
| H2O2 peroxidase substrate | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-65-02 | |
| K2HPO4 | Sigma | 795488 | |
| Kanamycin, kan | Fisher | AC61129 | 50 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL. |
| KH2PO4 | Sigma | P2222 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 94046 | |
| NaCl | Alfa Aesar | U19C015 | |
| Nanodrop | Fisher | ND2000C | |
| NaOH | Fisher | SS256 | ! CAUTION NaOH causes burns. |
| NON-Fat Powdered Milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| PEG-8000 | Fisher | BP233 | |
| Protein A-HRP conjugate | Invitrogen | 101123 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 22704 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Recombinant Protein L | Fisher | 77679 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T7 DNA polymerase | New England Biolabs | M0274S | |
| Tetracycline, tet | Sigma | T7660 | 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| Tryptone | Fisher | 0123-07-5 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| Ultrapure glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Uridine | Sigma | U3750 | 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL. |
| Yeast extract | VWR | DF0127-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E.coli CJ236 | New England Biolabs | E4141 | Genotype: dut– ung– thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA. |
| E.coli SS320 | Lucigen | 60512 | Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production. |
| M13KO7 | New England Biolabs | N0315S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2-cm gap electroporation cuvette | BTX | ||
| 96-well 2mL Deep-well plates | Fisher | 278743 | |
| 96-well Maxisorp immunoplates | Nunc | 151759 | |
| Baffled flasks | Corning | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5811000096 | |
| Centrifuge bottles | Nalgene | ||
| ECM-630 electroporator | BTX | ||
| Magnetic stir bars | Nalgene | ||
| Thermo Fisher centrifuge | Fisher | ||
| High speed shaker | TAITEK | MBR-034P | |
| Microplate shaker | QILINBEIER | QB-9002 | |
| Liquid handler for 96 and 384 wells | RAININ | ||
| Mutil-channel pipette | RAININ | E4XLS | |
| Amicon concentrator | Merck | UFC803096 |
References
- Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
- Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
- Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
- Hutchison, C. A., et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Sidhu, S. S. . Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , (2005).
- Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
- Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
- Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
- Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
- Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
- Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
- Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
- Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
- Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
- Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
- Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
- Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. . Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 157-180 (2006).
- Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574 (2017).
- Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring?. Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
- Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
- Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
- Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
- Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics – the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).
