합성 살 균 소의 건설 맞춤형 다양성 팹 라이브러리 표시
Summary
이 프로토콜에서는 맞춤형 다양성 합성 항 체 살 균 소 전시 도서관의 건설에 대 한 자세한 절차를 설명합니다. 합성 항 체는 질병 진단 및 치료제를 기초 연구에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.
Abstract
단일 클론 항 체 (mAbs) 기초 연구와 의학에 대 한 수요는 매년 증가 하 고 있다. Hybridoma 기술 mAb 개발 이후 1975 년에 그것의 첫 번째 보고서에 대 한 지배적인 방법 되었습니다. 대체 기술, mAb 개발에 대 한 파지 디스플레이 방법으로 점점 더 매력적인 Humira, 첫 번째 페이지에서 파생 된 항 체와 베스트 셀러 mAbs 중은 2002 년에 류 마티스 관절염의 임상 치료에 대 한 승인 이후입니다. 비 동물 mAb 개발 기술을 기반으로, 살 균 소 전시 항 원 immunogenicity, 인간 화, 그리고 전통적인 hybridoma 기술 기반 항 체 개발에서 필요한 동물 유지 보수를 무시 합니다. 이 프로토콜에서 우리는 합성 살 균 소 표시 팹 라이브러리의 109-1010 단일 electroporation에 얻을 수의 다양성을 건설 하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 구성: 1) 고효율 전기 유능한 세포 준비; 2) 추출 uracil 포함 하는 단일 가닥 DNA (뒤-ssDNA); 3) Kunkel 메서드 기반 oligonucleotide 감독 mutagenesis; 4) electroporation 그리고 계산 라이브러리 크기; 5) 단백질 A/L 기반 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 폴딩에 대 한 기능적 다양성 평가; 그리고 6) 다양성의 DNA 순서 분석.
Introduction
mAbs 기초 연구에서 질병 진단 및 치료에 이르기까지 광범위 한 응용 프로그램 있다. 2016, 현재 60 mAbs 자가 면역 질환, 암, 그리고 전염병1,2의 임상 치료에 대 한 미국 식품의 약 청 (USFDA)에 의해 승인 되었습니다.
1975 년 Kohler와 Milstein 보고 ‘hybridomas’ 그리고이 기법은 라고도 셀룰러 소스에서 단일 클론 특이성의 항 체의 지속적인 세대를 위한 기술 의학 및 산업3 초석 이후 되고있다. ,4. 이 메서드에서 mAbs의 세대 항 원 생산, 마우스 면역, B 림프 톨의 추출, 치료 응용 프로그램에 대 한 불멸의 hybridoma 세포, 클론 선택, 형성 하기 위하여 myeloma 세포와 B 세포의 융해를 포함 하 여 다양 한 단계 필요 인간 화 인간 안티 마우스 항 체 (하 마)4,5을 피하기 위해 필요 합니다. 그러나,이이 기술에 대 한 항 독 소, 균, 그리고 높은 보존된 단백질을 포함 하 여 상대적으로 mAb 생산5에 대 한 vivo에서 면역 반응을 트리거링에 유효 하지 않습니다.
1978 년, 허 치 슨 외. 단일 가닥 살 균 소 바이러스6잔류물의 직접 mutagenesis는 oligonucleotide 사용 하 여 보고. 1985 년에, 스미스 보고 외국 유전자 파편 유전자 살 균 소의 외 투 단백질 III 인코딩 프레임에 융합 될 수 있다 하 고 따라서 그것의 infectivity7을 타협 하지 않고 살 균 소 표면에 표시 될 수 있습니다. 이 선구적인 작품에 면역, 순진한, 살 균 소 전시 항 체 라이브러리의 후속 건설에 대 한 토대를 마련 하 고 합성을 위한 단일 체인 변수 조각 (scFv)의 항 원 묶는 조각 (팹) 형식으로 형성 치료 mAb 개발8,9. 기술적인 관점에서 파지 디스플레이 기반 항 체 개발 hybridoma 기반 mAb 개발 일부 항 포즈 수 있는 한계를 우회 하는 데 도움이 수 있는 상호 보완적인 접근 방식을 제공 하 고는 인간 화 하는 과정 hybridoma 파생 된 항 체는 종종5가필요합니다. 2016, 현재 6 살 균 소 전시 파생 mAbs Humira, 류 마티스 관절염의 치료에 사용 되는 가장 성공적인 mAbs 중 하나를 포함 하 여 시장 승인 및 많은 파지 디스플레이 파생 된 항 체는 현재 임상의 다양 한 단계에서 조사10.
면역과 순 살 균 소 항 체 라이브러리, complementarity 결정의 다양성에 대 한 지역 (Cdr) 빛과 무거운 체인에 자연 면역 레 퍼 토리 (즉, B 세포에서)에서 파생 됩니다. 반면, 합성 살 균 소 항 체 라이브러리에서 Cdr의 다양성 완전히 인공입니다. 합성 접근 도서관 건축을 정밀 하 게 제어 순서 다양성의 디자인을 제공 항 체 구조의 기계 론 적인 연구에 대 한 기회를 제공 하 고 기능11,12. 또한, 합성 라이브러리 프레임 워크 라이브러리 건설 촉진 하류, 대규모 산업 개발11,12전에 최적화할 수 있습니다.
1985 년, Kunkel M13 살 균 소에 사이트 이동 돌연변이 효율적으로 소개 하는 단일 가닥 DNA (ssDNA) 템플릿 기반 mutagenesis 접근 보고13. 이 방법은 이후 살 균 소 전시 도서관의 건축을 위해 널리 사용 되었다. 화학적 합성된 DNA oligonucleotides 팹 Cdr에 다양성을 소개 하는 항 체 백본 템플릿을 phagemid에 통합 됩니다. 이 프로세스는 phagemid uracil 포함 된 ssDNA (뒤-ssDNA)로 표현 된다 고는 oligonucleotides는 Cdr에 단련는 이중 가닥 DNA (dsDNA) T7 DNA 중 합 효소 및 T4 DNA 리가 존재 합성 확장. 마지막으로, 생성 된 ds DNA electroporation에 의해 대장균 에 도입 될 수 있습니다.
높은 다양성, 살 균 소 전시 도서관 건설, 2 분 대 혼합 전기 유능한 세포와 covalently의 높은 전압 electroporation 닫힌된 원형 dsDNA (CCC-dsDNA) 신중 하 게 준비 한다. Sidhu 외. 전통적인 방법에서 크게 향상 된 라이브러리 다양성14전기-유능한 세포와 DNA의 준비를 수정.
이 프로토콜에서 우리는 합성 살 균 소 표시 팹 라이브러리의 109-1010 단일 electroporation에 얻을 수의 다양성을 건설 하는 방법을 설명합니다. 그림 1 에서는 도서관 건설 등의 개요: 1) 고효율 전기 유능한 세포 준비; 2) 뒤 ssDNA;의 추출 3) Kunkel 메서드 기반 oligonucleotide 감독 mutagenesis; 4) electroporation 그리고 계산 라이브러리 크기; 5) A/L 기반 ELISA 위한 단백질 폴딩 및 기능적 다양성 평가; 그리고 6) 다양성의 DNA 순서 분석. 모든 시 약, 긴장 및 장비 물자의 테이블에 나열 됩니다. 표 1 시 약 설치를 보여 줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
높은 다양성, 팹 라이브러리 페이지 표시, 품질 관리 구성 하 체크 포인트 전기 유능한 세포, 뒤 ssDNA 서식 파일의 효율성의 품질 역량을 포함 하 여 건설 과정의 다양 한 단계를 모니터링 하는 데 필요한 CCC dsDNA 합성, electroporation, 팹 접는 성과 아미노산 Cdr의 팹 파지 클론의 시퀀스 분석 후 titer.
고수익 뒤 ssDNA의 순도 높은 mutagenesis 속도 대 한 필수적입니다. 우리의 경험에서는…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자에 대 한 중요 한 의견 Kunkel의 방식 합성 팹 페이지 라이브러리 건설 Sidhu 연구소에서 박사 프레드릭 Fellouse 주셔서 감사합니다. 저자 감사 부인 Alevtina Pavlenco 및 높은 효율 전기 유능한 준비의 귀중 한 도움 Sidhu 실험실에서 다른 멤버 대장균 세포 및 고품질 뒤 ssDNA. 이 작품은 중국의 국가 자연과학 기초에 의해 지원 되었다 (허가 번호: 81572698, 31771006) DW 및 ShanghaiTech 대학으로 (부여 번호: F-0301-13-005) 항 체 공학의 실험실에.
Materials
| Reagents | |||
| 1.0 M H3PO4 | Fisher | AC29570 | |
| 1.0 M Tris, pH 8.0 | Invitrogen | 15568-025 | |
| 10 mM ATP | Invitrogen | 18330-019 | |
| 100 mM dithiothreitol | Fisher | BP172 | |
| 100 mM dNTP mix | GE Healthcare | 28-4065-60 | solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-76-02 | |
| 50X TAE | Invitrogen | 24710030 | |
| Agarose | Fisher | BP160 | |
| Carbenicillin, carb | Sigma | C1389 | 100 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL. |
| Chloramphenicol, cmp | Sigma | C0378 | 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9620G | |
| Granulated agar | VWR | J637-500G | |
| H2O2 peroxidase substrate | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-65-02 | |
| K2HPO4 | Sigma | 795488 | |
| Kanamycin, kan | Fisher | AC61129 | 50 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL. |
| KH2PO4 | Sigma | P2222 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 94046 | |
| NaCl | Alfa Aesar | U19C015 | |
| Nanodrop | Fisher | ND2000C | |
| NaOH | Fisher | SS256 | ! CAUTION NaOH causes burns. |
| NON-Fat Powdered Milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| PEG-8000 | Fisher | BP233 | |
| Protein A-HRP conjugate | Invitrogen | 101123 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 22704 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Recombinant Protein L | Fisher | 77679 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T7 DNA polymerase | New England Biolabs | M0274S | |
| Tetracycline, tet | Sigma | T7660 | 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| Tryptone | Fisher | 0123-07-5 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| Ultrapure glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Uridine | Sigma | U3750 | 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL. |
| Yeast extract | VWR | DF0127-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E.coli CJ236 | New England Biolabs | E4141 | Genotype: dut– ung– thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA. |
| E.coli SS320 | Lucigen | 60512 | Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production. |
| M13KO7 | New England Biolabs | N0315S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2-cm gap electroporation cuvette | BTX | ||
| 96-well 2mL Deep-well plates | Fisher | 278743 | |
| 96-well Maxisorp immunoplates | Nunc | 151759 | |
| Baffled flasks | Corning | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5811000096 | |
| Centrifuge bottles | Nalgene | ||
| ECM-630 electroporator | BTX | ||
| Magnetic stir bars | Nalgene | ||
| Thermo Fisher centrifuge | Fisher | ||
| High speed shaker | TAITEK | MBR-034P | |
| Microplate shaker | QILINBEIER | QB-9002 | |
| Liquid handler for 96 and 384 wells | RAININ | ||
| Mutil-channel pipette | RAININ | E4XLS | |
| Amicon concentrator | Merck | UFC803096 |
References
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