Byggandet av syntetiska Phage visas Fab bibliotek med skräddarsydd mångfald
Summary
Det här protokollet beskriver ett detaljerat förfarande för byggandet av en phage-visas syntetiska antikroppsbiblioteket med skräddarsydd mångfald. Syntetiska antikroppar har breda program från grundforskning till sjukdom diagnostik och therapeutics.
Abstract
Efterfrågan på monoklonala antikroppar (mAbs) i grundläggande forskning och medicin ökar årligen. Hybridomteknik teknik har varit den dominerande metoden för mAb utveckling sedan sin första rapport i 1975. Som en alternativ teknik är phage display metoder för mAb utveckling allt mer attraktivt eftersom Humira, första phage-derived antikroppen och en av de bäst säljande mAbs, godkändes för klinisk behandling av reumatoid artrit i 2002. Som en icke-animalisk baserat mAb utveckling teknik, kringgår phage display antigen immunogenicitet, humanisering och djur underhåll som krävs från traditionella Hybridomteknik teknikbaserade antikroppsutveckling. I detta protokoll beskriver vi en metod för byggandet av syntetiska phage-visas Fab bibliotek med mångfalder av 109-10-10 som kan erhållas med en enda elektroporation. Detta protokoll består av: 1) högeffektiv electro-behöriga cell förberedelse; (2) utvinning av uracil-innehållande enkelsträngat DNA (dU-ssDNA); (3) Kunkels metod baserad oligonukleotiden riktad mutagenes; (4) elektroporation och beräkning av bibliotek storlek; (5) protein A/L-baserad enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) för vikning och funktionella mångfald utvärdering. och 6) DNA sekvensanalys av mångfald.
Introduction
mAbs har breda program sträcker sig från grundforskning till sjukdom diagnostik och therapeutics. Från och med 2016, har mer än 60 mAbs godkänts av United States Food and Drug Administration (USFDA) för klinisk behandling av autoimmuna sjukdomar, cancer och infektionssjukdomar1,2.
I 1975 rapporterade Kohler och Milstein en teknik för kontinuerlig produktion av antikroppar av en enda klonal specificitet från en cellulär källa kallad ‘hybridomceller’ och denna teknik har därefter blivit en hörnsten inom medicin och industri3 ,4. Generation av mAbs av denna metod kräver olika steg inklusive antigen produktion, mus immunisering, utvinning av B-lymfocyter, fusion av B-celler med myelomceller att bilda odödliga Hybridomteknik celler, klon urval, och för terapeutiska tillämpningar, humanisering krävs att undvika human antimus-antikropp (HAMA)4,5. Men för denna teknik är antigener inklusive toxiner, patogener och mycket proteiner relativt ineffektiv utlösa ett i vivo immunsvar för mAb produktion5.
1978 rapporterade Hutchison et al. användning av en oligonukleotid till direkta mutagenes av en restprodukt i ett enkelsträngat bacteriophage virus6. 1985 rapporterade Smith att utländska gen fragment kan vara smält i ram med den gen som kodar phage coat protein III och kan därmed visas på phage ytan utan att kompromissa med dess smittsamhet7. Dessa banbrytande verk lade en grund för efterföljande byggandet av phage-visas antikropp bibliotek i immun, naiv och syntetiska bildar med format av singel-kedjan variabel fragment (scFv) och antigen-bindande fragment (Fab) för terapeutiska mAb utveckling8,9. Från teknisk synvinkel, phage display-baserade antikroppsutveckling erbjuder en kompletterande strategi till hybridom-baserade mAb utveckling som kan bidra till att kringgå de begränsningar som vissa antigener kan utgöra och humanisering process som hybridom-derived antikroppar kräver ofta5. Från och med 2016 6 phage display-derived mAbs har godkänts på marknaden inklusive Humira, en av de mest framgångsrika mAbs används för behandling av reumatoid artrit, och många phage display-derived antikropp kandidater är för närvarande i olika stadier av klinisk undersökningen10.
För immun- och naiva phage antikropp bibliotek, mångfalden av komplementaritet-bestämma regionerna (cdr-skivor) i lätta och tunga kedja härleds från den naturliga immuna repertoaren (dvs.från B-celler). Däremot är mångfalden av cdr-skivor i syntetiska phage antikropp bibliotek helt konstgjorda. Syntetiska metoder för bibliotek konstruktion ger exakt kontroll över utformningen av sekvens mångfald och erbjuda möjligheter för mekanistiska studier av antikropp struktur och funktion11,12. Ramen för syntetiska bibliotek kan dessutom optimeras innan biblioteket konstruktion att underlätta nedströms, storskalig industriell utveckling11,12.
1985, Kunkel rapporterade ett enkelsträngat DNA (ssDNA) mallbaserade mutagenes strategi att införa webbplats riktad mutationer i M13 bacteriophage effektivt13. Denna metod användes därefter allmänt för byggandet av phage-visas bibliotek. Kemiskt syntetiserade DNA oligonukleotider utformad för att införa mångfald i Fab CDRs införlivas i en phagemid med en antikropp ryggraden mall. I denna process, phagemid uttrycks som en uracil-innehållande ssDNA (dU-ssDNA) och oligonukleotider är glödgas på CDRs och utvidgas till att syntetisera dubbelsträngat DNA (dsDNA) T7 DNA-polymeras och T4 DNA-ligase närvaro. Slutligen, genererade ds-DNA kan införas i Escherichia coli genom elektroporation.
För hög mångfald, phage-visas bibliotek konstruktion, hög spänning elektroporation av en två-komponent blandning av electro-kompetenta celler och kovalent bör stängda cirkulär dsDNA (CCC-dsDNA) förberedas noga. Sidhu et al. modified utarbetandet av electro-kompetenta celler och DNA från traditionella metoder och kraftigt förbättrad bibliotek mångfald14.
I detta protokoll beskriver vi en metod för byggandet av syntetiska phage-visas Fab bibliotek med mångfalder av 109-10-10 som kan erhållas med en enda elektroporation. Figur 1 visar en översikt över bibliotek konstruktion inklusive: 1) högeffektiv electro-behöriga cell förberedelse; (2) utvinning av dU-ssDNA; (3) Kunkels metod baserad oligonukleotiden riktad mutagenes; (4) elektroporation och beräkning av bibliotek storlek; (5) protein A/L-baserad ELISA för vikning och funktionella mångfald utvärdering. och 6) DNA sekvensanalys av mångfald. Alla reagenser, stammar och utrustning listas i materialets tabell. Tabell 1 visar reagens setup.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att konstruera hög mångfald, phage-visas Fab bibliotek, kvalitetskontroll behövs kontrollpunkter för att övervaka olika skeden av byggprocessen, inklusive kompetensen av electro-kompetenta celler, kvaliteten på mallen dU-ssDNA, effektivitet CCC-dsDNA syntes, titer efter elektroporation, Fab vikning och aminosyra mångfald av cdr-skivor av sekvensanalys av Fab-phage kloner.
Hög avkastning och renhet av dU-ssDNA är viktigt för hög mutagenes. Vår erfarenhet, kan phage induktion vi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna uppskattar Dr Frederic Fellouse från Sidhu lab för kritiska synpunkter på Kunkels metod baserad syntetisk Fab phage bibliotek konstruktion. Författarna uppskattar Mrs. Alevtina Pavlenco och andra medlemmar från Sidhu lab för värdefull hjälp med att förbereda högeffektiv electro-behöriga E. coli celler och hög kvalitet dU-ssDNA. Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation Kina (Grant No.: 81572698, 31771006) till DW och vid ShanghaiTech universitet (Grant No.: F-0301-13-005) till laboratorium av antikropp Engineering.
Materials
| Reagents | |||
| 1.0 M H3PO4 | Fisher | AC29570 | |
| 1.0 M Tris, pH 8.0 | Invitrogen | 15568-025 | |
| 10 mM ATP | Invitrogen | 18330-019 | |
| 100 mM dithiothreitol | Fisher | BP172 | |
| 100 mM dNTP mix | GE Healthcare | 28-4065-60 | solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-76-02 | |
| 50X TAE | Invitrogen | 24710030 | |
| Agarose | Fisher | BP160 | |
| Carbenicillin, carb | Sigma | C1389 | 100 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL. |
| Chloramphenicol, cmp | Sigma | C0378 | 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9620G | |
| Granulated agar | VWR | J637-500G | |
| H2O2 peroxidase substrate | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-65-02 | |
| K2HPO4 | Sigma | 795488 | |
| Kanamycin, kan | Fisher | AC61129 | 50 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL. |
| KH2PO4 | Sigma | P2222 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 94046 | |
| NaCl | Alfa Aesar | U19C015 | |
| Nanodrop | Fisher | ND2000C | |
| NaOH | Fisher | SS256 | ! CAUTION NaOH causes burns. |
| NON-Fat Powdered Milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| PEG-8000 | Fisher | BP233 | |
| Protein A-HRP conjugate | Invitrogen | 101123 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 22704 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Recombinant Protein L | Fisher | 77679 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T7 DNA polymerase | New England Biolabs | M0274S | |
| Tetracycline, tet | Sigma | T7660 | 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| Tryptone | Fisher | 0123-07-5 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| Ultrapure glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Uridine | Sigma | U3750 | 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL. |
| Yeast extract | VWR | DF0127-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E.coli CJ236 | New England Biolabs | E4141 | Genotype: dut– ung– thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA. |
| E.coli SS320 | Lucigen | 60512 | Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production. |
| M13KO7 | New England Biolabs | N0315S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2-cm gap electroporation cuvette | BTX | ||
| 96-well 2mL Deep-well plates | Fisher | 278743 | |
| 96-well Maxisorp immunoplates | Nunc | 151759 | |
| Baffled flasks | Corning | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5811000096 | |
| Centrifuge bottles | Nalgene | ||
| ECM-630 electroporator | BTX | ||
| Magnetic stir bars | Nalgene | ||
| Thermo Fisher centrifuge | Fisher | ||
| High speed shaker | TAITEK | MBR-034P | |
| Microplate shaker | QILINBEIER | QB-9002 | |
| Liquid handler for 96 and 384 wells | RAININ | ||
| Mutil-channel pipette | RAININ | E4XLS | |
| Amicon concentrator | Merck | UFC803096 |
References
- Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
- Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
- Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
- Hutchison, C. A., et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Sidhu, S. S. . Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , (2005).
- Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
- Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
- Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
- Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
- Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
- Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
- Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
- Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
- Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
- Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
- Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
- Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. . Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 157-180 (2006).
- Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574 (2017).
- Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring?. Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
- Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
- Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
- Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
- Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics – the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).
