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Bioingegneria

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

Published: September 07, 2018
doi:
10.3791/57377
, , , , , , , , , , , , , , , ,
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS),Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology,Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering,Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources,Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research,Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

Summary

この資料は、物理と化学の高スループット操作キューが模倣した生体内で細胞微小と多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列を準備する詳細な方法についてを説明します単一セルのプロファイリングとひと多能性幹細胞 (hPSCs) に最適な携帯電話環境を識別します。

Abstract

携帯電話微小はさまざまな成長因子、細胞外マトリックスは、細胞間相互作用などの手がかりから成っています。これらの手がかりも仕組まれた、生活システムの細胞機能の調節に重要であります。研究者の数は、必要な細胞の機能と環境要因の関係を明らかにしようとしましたが多くは未知に残る。これは、主にこのような環境の手がかりの in vitroを模倣し、同時に細胞の環境手がかり別のテストに適切な方法論の不足のためです。マイクロ流路と高コンテンツの単一細胞解析、環境の異なる要因によって変更される幹細胞表現型を調べるために続いてナノファイバー アレイの統合プラットフォームを報告する.このプラットフォームのアプリケーションを示すためには、この研究は、ひと多能性幹細胞 (hPSCs) の自己更新の表現型について説明します。多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列の作製におけるナノファイバー配列およびマイクロ構造の作製手順を紹介します。さらに、プロファイルでは、複数の蛍光マーカー、複数の蛍光イメージング統計解析と染色細胞単一細胞の全体的な手順を説明します。

Introduction

ひと多能性幹細胞 (hPSCs)1,2限りなく自己更新し、様々 な組織の血統があり、医薬品開発、細胞ベースの治療、ティッシュ エンジニア リング、再生医療に革命を起こす可能性を分化3,4,5,6一般的な文化料理、マイクロタイター プレートは細胞の拡張のための重要な要因である範囲のナノ-マイクロ/メートル、細胞レベルでの正確な物理的および化学的細胞操作を有効にするには設計されていない。自己複製と分化。この欠点に対処するための研究は細胞の運命決定とセル関数4の調節に細胞の微小の役割を検討しました。近年、研究数の増加は、細胞の微小培養7、8を再構築するため行われています。化学9,10、11,12,13の操作を介してこれらの微小のナノ ・ マイクロ加工プロセスを確立しました。 14,15,16,17物理18,19,20環境手がかり。今までは、細胞の運命決定と単一のプラットフォームの機能に関する化学的・物理的環境手がかりの基になるメカニズムを体系的に調査への報告はありませんでした。

堅牢なスクリーニング プラットフォーム (図 1) を確立するシンプルなデザインの原則に基づいて戦略を紹介します。まず、ナノファイバー配列およびマイクロ構造体を使用して汎用性の高い、人工細胞微小を作成するための統合プラットフォームを開発する手順について述べる: 配列の多重化人工細胞微小環境 (MACME)(図 1Aおよび2 a)。ナノファイバーの配列では、ナノファイバー材料と密度のさまざまな組み合わせで 12 の異なる微小があります。静電紡糸ナノファイバーを作製する使用されました。ポリスチレン (PS)21polymethylglutarimide (PMGI)22ゼラチン (GT)23など、ナノファイバー材料が細胞接着と多能性 (のメンテナンスに影響を与える可能性があります彼らの化学的性質をテストするのには設計されていた図 2B)。エレクトロスピニング時間を変更することによって変化したナノファイバーの密度と生成されたナノファイバーの密度によると定義された (D と、リタイア = XLow/低/中/高)。ポリジメチルシロキサン (PDMS) 96 ウェル マイクロ プレートの標準寸法に沿って配置することができます 48 の細胞培養室をかくまっているマイクロ構造が構成されます。PDMS は、マイクロ流体デバイス24を作製する一般的に使用される生体適合性とガス交換ポリマーです。各マイクロ流路設計されました 700 μ m ワイドと 8.4 mm 長く (表 1) の端の 2 つの入り江があった。部屋は高さの異なる (250、500、および 1000 μ m)、初期細胞播種密度 (0.3、0.6、1.2 × 105セル/cm2)、hPSCs25 の分化、増殖、生存と相関する可能性がありますを操作するには(図 2C)。商工会議所に播種された細胞の数室床の上列密度に比例し、したがって初期細胞播種密度が異なる高さ文化区域に同じ細胞懸濁液を導入によって制御されました。すべてのチャンネルは ≥ 250 μ m 高26細胞の低酸素分圧27とせん断応力の28の影響を最小限に抑えるために設計されています。チャネル 250、500、1000 μ m の高さはここで省略表記として X と東カリブ ドル = 低中、高それぞれ。「Material_NF density_Cell 密度」として短くされた明確なナノファイバー密度と初期細胞播種密度と環境 (例えば、GT_HighNF_HighCD: 高密度 GT ナノファイバーと高い初期細胞播種によって特徴づけられる環境密度)。

その後、我々 は環境要因 (図 1B) への応答での細胞行動を体系的に調査する単一細胞解析を実行する方法をについて説明します。証拠の-概念として、hPSC の自己複製に最適な携帯電話環境を識別される、hPSC メンテナンス (図 1B)29のための重要な機能であります。イメージ ベース フローサイトメトリー、統計解析に続いてセルラ環境への個々 の形質細胞の定量的解釈ことができます。細胞機能の変化の中では、このペーパーは hPSC の自己複製を維持するための最適の条件を識別するために詳細な手順を提供します。

Protocol

1. MACME アレイの作製 注: すべての材料および装置の材料表のとおりです。 ナノファイバーの配列およびマイクロ構造の金型のマスクの準備 ナノファイバーの配列および 3 D コンピュータ ・ グラフィックス ソフトウェア パッケージ (表 1) を用いたマイクロ構造の金型に使用されるマスクの三次元 (3 D) 画像を作成します。<strong…

Representative Results

MACME アレイ: 設計と製作:ナノファイバー技術と組み合わせて、マイクロ細胞培養とスクリーニング以前 hPSC の自己複製と分化35,36 (図 1) のための最適な条件を識別するために用いられる技術を使いました。これは細胞培養チャンバーと条件が正確に制御可能な拡張可能な42</sup…

Discussion

このプロトコルは、修飾 hPSCs の維持のための堅牢な文化システムを確立する最初のスクリーニング方法をについて説明します。まず、我々 はプラットフォームとして、多様な人工 Ecm と細胞ナノファイバー配列、MACME 配列を持つ統合マイクロ流体デバイスを用いた播種量を準備する方法を説明します。第二に、定量的画像に基づく単一セル フェノタイピングだった実行50個…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ありがとう (名) 中辻教授京都大学 iCeMS でヒト ES 細胞を提供します。東京工業大学教授 A. 丸山をありがとうございますまた原子間力顕微鏡の使用の彼をサポートします。惜しみなく学術振興会によって提供された資金 (JSP; 22350104、23681028、25886006、および 24656502)。資金は、新エネルギー ・産業技術総合開発機構 (NEDO) テルモ ライフ サイエンス振興財団によって提供されたも。WPI iCeMS は、世界最高峰国際研究センター (WPI)、教育省、文化、スポーツ、科学、技術 (文部科学省)、日本によってサポートされます。この仕事の一部は京都大学ナノテクノロジー ハブ、日本文部科学省主催「ナノテクノロジー基盤プロジェクト」に産総研ナノ処理設備によって支えられました。

Materials

Polystyrene (PS) Sigma #182435 Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000
Polymethylglutarimide (PMGI) MicroChem G113113
Gelatin (GT) Sigma G2625 From porcine skin, type A
Sylgard 184 silicone elastomer kit Doe Corning Toray #1064291 PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit.
OpenSCAD This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device.
AutoCAD 2014 Autodesk This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation.
3D printer, AGILISTA-3000 Keyence
UV-curable resin, AR-M2 Keyence This is used for 3D printing by Agilista.
Acetic acid Sigma #338826 ≥99.99%
Ethyl acetate Sigma #270989 Anhydrous, 99.8%
Tetrahydrofuran (THF) Sigma #401757
MSP-30T Vacuum Device Magnetron sputtering machine
Nunc OmniTray Thermo Fisher Scientific #242811 This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. 
Gun-type corona discharge machine Shinko Electric & Instrumentation CFG-500 This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol.
5 mL syringe Terumo SS-05SZ
Stainless-steel blunt needle (23-gauge) Nipro #2166 Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively.
High-voltage power supply TechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride Dojindo W001
N-Hydroxysuccinimide Sigma #56480
Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning #354277 This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol.
CellAdhere Vitronectin, Human, Solution STEMCELL Technologies #07004
TeSR-E8 STEMCELL Technologies #05940 Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells
Y-27632 Wako Pure Chemical Industries #253-00513
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Thermo Fisher Scientific #12605028 This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells.
Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides Thermo Fisher Scientific C10086 The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit.
Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13203
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Oct-3/4 Antibody (C-10) Santa Cruz Biotechnology sc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) abcam ab96875 This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining.
ECLIPSE Ti-E Nikon This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced Research Nikon This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition.
CellProfiler, Version 2.1.0 This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/).
R SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0 This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software.
Java TreeView This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram.
H9 human embryonic stem cell WiCell Stem Cell Bank WA09
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Riferimenti

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Keywords: 3D PrintingElectrospinningPolymer SolutionsNanofiber ArraysMicrofluidic StructuresCrosslinkingCellular MicroenvironmentStem Cell Engineering
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Mashimo, Y., Yoshioka, M., Tokunaga, Y., Fockenberg, C., Terada, S., Koyama, Y., Shibata-Seki, T., Yoshimoto, K., Sakai, R., Hakariya, H., Liu, L., Akaike, T., Kobatake, E., How, S., Uesugi, M., Chen, Y., Kamei, K. Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array. J. Vis. Exp. (139), e57377, doi:10.3791/57377 (2018).
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