장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하
Summary
라이브 셀 이미징 고정된 셀 이미징 혼자 여 달성 하지 않은 단일 셀 이나 전체 인구에 풍부한을 정보를 제공 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 프로토콜 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하는 설명 합니다.
Abstract
라이브 셀 이미징은 직접 시간의 연장된 기간 동안 단일 세포에서 생물 학적 현상을 시각화 하는 데 사용할 수 있는 강력한 기술입니다. 지난 10 년간, 새롭고 혁신적인 기술을 크게 라이브 셀 이미징의 실용성을 향상 했다. 세포는 이제 초점에 보관 하실 수 있습니다 하 고 지속적으로 유지에서 37 °C, 5% CO2 동안 몇 일 동안 셀 문화 조건 군데. 또한, 다른 실험 조건을 나타내는 여러 필드 볼 수 있습니다 취득 될 동시에, 따라서 높은 처리량 실험적인 데이터를 제공 하. 라이브 셀 이미징 직접 시각화 및 동적 셀룰러 이벤트의 시간 정량 함으로써 고정 셀 이미징에 상당한 이점을 제공 합니다. 라이브 셀 이미징 또한 그렇지 않으면 되었습니다 놓친 것 인구 기반 분석을 사용 하 여 단일 셀의 행동에 변화를 식별할 수 있습니다. 여기, 우리 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하기 위해 라이브 세포 이미징 프로토콜을 설명 합니다. Mitotically 여부를 시각화 하는 방법을 체포 유사 분열 또는 interphase에 다시 슬립에서 직접 셀 다 설명 합니다. 우리는 또한 형광 ubiquitination 기반 세포 주기 표시기 (FUCCI) 시스템을 사용 하 interphase 셀 mitotic 미끄럼에서 태어난 세포 주기를 다시 입력 할 수 있는 부분을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 핵 파열 이벤트를 식별 하는 라이브 셀 이미징 방법을 설명 합니다.
Introduction
반대로 mitotic 마약과 긴 단단한 종양의 다양 한 종류의 화학요법 식이요법에 사용 되었습니다 종종 위대한 효능1,2,3를 표시. Mechanistically, 이러한 약물 정상적인 mitotic 진행 하 고 급속 하 게 확산에 mitotic 체포 홍보 암 세포. 그러나, 셀 mitotic 체포에 대 한 응답에서 운명이 매우 변수: 셀의 일부 유사 분열에서 세포 죽음을 겪 습, 하는 동안 다른 유사 분열에서 나가고 interphase tetraploid 셀 (프로세스 라고 mitotic 미끄럼)으로 돌아갑니다4, 5,6,,78. 이러한 interphase 세포 apoptosis를 실행, 영구 세포 주기 검거를 받아야 하거나 입력할 수 있습니다 심지어 다시는 세포 주기4,,56,7,8,9 ,,1011. Interphase, 다시 약물 제거 다음 세포 주기를 입력에에 걸리고 여 mitotic 세포 죽음을 회피 하는 셀은 암 세포 인구의 재 출현에 따라서 기여할 수 있습니다. 또한, 세포 유사 분열에서 슬립 tetraploid, 고 홍보는 종양 염색체 불안정 하 알려져 tetraploidy12,13,,1415재발. 세포 운명 안티 mitotic 약물 치료에 대 한 응답에서을 제어 하는 요소를 정의 하는 것은 따라서 현재 치료제를 최적화 하기 위해 중요 한입니다.
이 프로토콜에서 우리가 직접 관찰 하 고 장기간된 mitotic 체포 안티 mitotic 마약 paclitaxel에 대 한 응답에서을 받아야 하는 셀의 운명을 연구 하는 방법을 설명 합니다. Paclitaxel는 설립은 병원에서 치료는 유 방, 난소, 그리고 폐16,17,,1819, 의 그들을 포함 하 여 많은 종양 종류에 높은 효능 입증 20. 주목 나무의 껍질에서 파생 된 식물 알칼로이드는 Paclitaxel microtubules 안정화 및 따라서 그들의 통합과21,22를 방지. Paclitaxel에 의해 microtubule 역학의 감쇄 미치지 않습니다 G1 부터 G2 에서 세포 주기 진행 하는 동안 약 이어질지 않습니다 유사 분열 동안 스핀 들 어셈블리 검사점의 지속적인된 활성화 방해 하 여 kinetochore-microtubule 첨부 파일 (여기 심층에서 검토23,24)25. 결과적으로, anaphase 발병 paclitaxel 치료 세포와 장기 mitotic 체포에서 결과 방지 된다.
이 프로토콜 먼저 라이브 셀 이미징 실험에 mitotic 세포를 식별 하는 방법을 설명 합니다. 유사 분열은 두 눈에 띄는 셀 생물 학적 변경 부착 조직 배양 세포에서 구상 될 수 있다. 첫째, 염색체 핵 붕괴 직전 높은 응집 된다. 동안 종종 표준 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 감지, 염색체 응축 수 더 명확 하 게 검출 될 형광을 사용 하 여 태그를 레이블 염색체 (예: 붙일 표시 된 히스톤 단백질). 두 번째, mitotic 세포는 또한 셀 반올림에 기인 하는 극적인 형태학 변화에 의해 식별할 수 있습니다.
이 프로토콜 것입니다 다음 라이브 셀 이미징 접근을 사용 하 여 장기간된 mitotic 체포를 발생 하는 셀의 운명을 추적 하는 방법을 보여 줍니다. 세포 유사 분열에서 체포 중 세 가지 운명을 겪는 다. 첫째, 세포는 유사 분열 동안에 세포 죽음을 받을 수 있습니다. 이 현상은 죽어가는 세포 축소, bleb, 또는 파열 관찰은 가벼운 현미경 검사 법에 의해 쉽게 시각화 됩니다. 둘째, 세포는 유사 분열에서 종료할 수 그리고 interphase 염색체 분리 또는 cytokinesis 없이 다시 복귀, 프로세스 라고 mitotic 미끄럼. 염색체의 decondensation 또는 쉽게 mitotic 셀 병합이 프로세스를 식별 합니다. 유사 분열에서 슬립 셀도 종종 불규칙 한, 다중 lobed 핵을 표시 하 고 자주 여러 micronuclei5항구. 셋째, 세포 유사 분열에서 체포 anaphase 시작 하 고 긴 지연 후 유사 분열을 진행할 수 있습니다. 드문 높은 약물 농도에, 하는 동안이 동작 체포 셀 스핀 들 어셈블리 검사점을 만족 수 있습니다 또는 스핀 들 어셈블리 검사점은 부분적으로 약화 또는 결함이 있는 제안 합니다. Anaphase 발병 염색체 분리 및 후속 cytokinesis 라이브 셀 이미징 사용 하 여 구상 될 수 있다.
겪고 mitotic 미끄럼에 의해 mitotic 세포 죽음을 회피 하는 셀의 운명을 추적 하 라이브 셀 이미징 방법은 또한 설명 합니다. Mitotic 미끄럼을 받아야 하는 셀 후속 interphase에, 튼튼한 G1 세포 주기 검거, 실행 하거나 다시 세포 분열4의 새로운 라운드를 시작 하는 세포 주기를 입력 합니다. Mitotic 미끄럼 다음 세포 주기를 다시 입력 하는 셀의 일부분을 FUCCI (형광 ubiquitination 기반 세포 주기 표시기) 시스템을 사용 하 여 접근 방식을 설명 합니다. FUCCI G1/S 전환의 직접적인 시각화 가능 하며 장기 라이브 셀 이미징 생체 외에서 그리고 vivo에서26,27와 함께 사용 될 수 있습니다. FUCCI 시스템은 두 개의 붙일 레이블된 단백질, hCdt1의 잘린된 형태 활용 (chromatin 라이선스 및 DNA 복제 요소 1) 및 hGeminin, 누구의 수준 진동 세포 주기 위치에 따라. hCdt1 (빨간 형광 단백질을 융합) SCFSkp2 G1 단계 어디 그것 복제, DNA를 라이센스 하는 역할을 하지만 E3 유비퀴틴 리가 여 ubiquitinated 동안 높은 수준에서 현재 고 방지 하기 위해 S/G2/M 단계 동안 저하 다시 복제 DNA26의입니다. 대조적으로, hGeminin (녹색 형광 단백질에 융합), hCdt1의 억제제 인 레벨 피크 S/G2/M, 동안 이지만 E3 유비퀴틴 리가 APC에 의해 ubiquitinatedCdh1 G1 에 걸쳐 유사 분열의 끝에 타락 26. 셀 S/G2/M 동안 G1, 및 녹색 형광 동안 빨간색 형광을 전시로 FUCCI 세포 주기 단계, 간단한 형광 판독을 제공 따라서. FUCCI 시스템은 중요 한 사전 (bromodeoxyuridine 얼룩) 등 다른 방법을 통해 증식 세포, 셀 고정 필요 하지 않습니다에 대 한 필요 없이 단일 셀 이미징에 대 한 추가 허용 하기 때문에 약리 세포 인구를 동기화 하는 치료. 이 프로토콜에 설명 하지, 하지만 추가 라이브 세포 센서 또한 G128, DNA 리가 RFP29 및 PCDNA GFP30 센서 helicase B 센서를 포함 하 여 세포 주기 진행을 시각화 하기 위해 개발 되었습니다. S 단계, 및 최근 FUCCI-4 센서는 세포 주기31의 모든 단계를 감지합니다.
마지막으로, 핵 파열을 감지 하는 라이브 셀 이미징 방법을 설명 합니다. 최근 연구는 암 세포의 핵 봉투는 불안정 하 고, 하는 경향이 수 있도록 nucleoplasm와 혼합할 하 세포질의 내용을 밝혀 있다. 이 현상, 핵 파열 되 나 DNA 손상 및 타고 난 면역 반응32,33,,3435,36,37, 의 자극을 홍보할 수 있습니다. 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. 핵 파열의 근본적인 원인은 불완전 특징이 유지, 핵 구조에서 변형 핵 파열42의 발생률이 증가 연관 알려져 있다. Paclitaxel 치료의 한 잘 알려진 효과 유사 분열; 다음 기 막히게 비정상적인 핵 구조의 생성 따라서, 라이브 셀 이미징 사용 하 여 핵 파열을 계량 하는 방법을 설명 합니다, 또한 paclitaxel 치료 핵 파열 이벤트의 빈도 증가 하는 경우를 탐험 하면서. 핵 파열 (예: 탠덤 이합체 핵 지 방화 신호, TDRFP-NLS를 융합 하는 RFP의 반복) 세포질에 핵-타겟 형광 단백질의 관찰된 누설에 의해 감지할 수 있습니다. 이 누설 파열 이벤트의 간단한 정량 가능 눈으로 분명히 표시 됩니다.
이 프로토콜 인코딩된 무대와 autofocusing 소프트웨어 widefield epifluorescence 현미경을 필요 합니다. 인코딩된 단계 자동 소프트웨어 이미징 기간 동안 셀에 초점을 유지 하는 동안 정의 된 X-Y 좌표, 정밀 자동화 된 운동에 대 한 수 있습니다. 또한,이 프로토콜 장비와 37 ° C에서 셀 5% CO2 습도 유지 필요로 분위기. 이 온도 내에서 전체 현미경을 포함 하 여 달성 될 수 있다 고 분위기 제어 인클로저, 또는 그 로컬 무대 최고 장치를 사용 하 여 온도 및 환경 유지. 이 프로토콜에 사용 되는 단계 대조 목표는 계획 형 석 10 x 0.30의 숫자 조리개와. 그러나, 20 X 목표 단일 초점 평면에서 두 둥근된 mitotic 그리고 평평 interphase 셀을 식별 하기에 충분 한 있습니다. 단계 대조를 수행 하는 경우 (이 방법에 설명 된) 대로 이미징, 커버 수 유리 또는 플라스틱. 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경을 사용 하는 경우 빛의 도발은 방지 하기 위해 유리 커버를 사용 하는 것이 필수적입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
장기 라이브 셀 이미징의 가장 중요 한 측면은 몇 군데 되 고 세포의 건강을 하도록 하 고 있다. 세포 온도, 습도, 및 CO2 레벨에 관한 이하의 조건 등 최소한의 외부 환경 스트레스에 노출 될 필수적 이다. 로 셀 동작50영향을 알려져 있다 스트레스 이미징 photodamage 형광 여기 조명에서 제한 하는 것이 중요 이기도 합니다. Photodamage 제한 하는 것은 여러 가지 방법으로 다른<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AFB, MAV와 NJG 라이언 Quinton 원고와 아드리안 Salic TDRFP NLS 구문에 대 한 의견 감사 하 고 싶습니다. AFB, MAV NIGMS 바이오 약리학 훈련 그랜트 5T32GM008541에 의해 재정 지원 됩니다. NJG은 Shamim Ashraf Dahod 유 방 암 연구 실험실의 일원 이다와 NIH 교부 금 GM117150 및 CA 154531, 카린 Grunebaum 재단, 스미스 가족 보너스 프로그램, Searle 학자 프로그램 그리고 흑색 종 연구에 의해 지원 됩니다. 얼라이언스입니다.
Materials
| phenol red-free, DMEM:F12 media | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| 12-well glass bottomed imaging dish | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Environmental Chamber | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisherbrand | 05-539-12 | |
| 10 cm polystyrene tissue culture plates | Falcon | 08772E | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Fisherbrand | 4488 | |
| 5804R 15 amp Centrifuge | Eppendorf | 97007-370 | |
| 1000 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| 20 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| p1000 Pipette Tips | Sharp | p1126 | |
| p20 Pipette Tips | Sharp | P1121 | |
| RPE-1 Cells | ATCC | CRL-4000 | |
| Incubator Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipette Boy | Integra | 156401 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging | Micro Video Instruments, Inc. | MEA53100 | |
| Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H117P1N4 | |
| Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H31XYZE | |
| Andor Digital Camera | Micro Video Instruments, Inc. | D10NLC | |
| Nikon NIS Elements AR Software | Micro Video Instruments, Inc. | MQS31000 | |
| SOLA LED Illuminator for Fluorescence | Micro Video Instruments, Inc. | SOLA-E | |
| InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control | Micro Video Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece | Micro Video Instruments, Inc. | MEP59391 | |
| Ti-C System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL51000 | |
| Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL56200 | |
| Te-C LWD Ph1 Module | Micro Video Instruments, Inc. | MEH41100 | |
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | MRH10101 | |
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective | Micro Video Instruments, Inc. | MRH48230 |
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