À long terme vivre-cellule d’imagerie afin d’évaluer le sort de la cellule en réponse au Paclitaxel
Summary
Imagerie de cellules vivantes fournit une foule de renseignements sur des cellules individuelles ou des populations entières qui est inaccessible par cellule fixe d’images seul. Ici, les protocoles d’imagerie de cellules vivantes pour évaluer les décisions de sort de cellule après un traitement par le paclitaxel drogue anti mitotique sont décrits.
Abstract
Imagerie de cellules vivantes est une technique puissante qui permet de visualiser directement des phénomènes biologiques dans des cellules individuelles sur de longues périodes de temps. Ces dix dernières années, les technologies nouvelles et novatrices ont grandement amélioré l’aspect pratique de l’imagerie de cellules vivantes. Les cellules peuvent désormais être conservés en bref et imagé en continu sur plusieurs jours tout en entretien dans 37 °C et 5 % CO2 conditions de culture cellulaire. En outre, plusieurs champs de vision représentant les différentes conditions expérimentales peuvent être acquises en même temps, fournissant ainsi des données expérimentales de haut débit. Imagerie de cellules vivantes fournit un avantage significatif sur l’imagerie de cellules fixes en permettant la visualisation directe et au dosage temporelle des événements cellulaires dynamiques. Imagerie de cellules vivantes peut également identifier des variations dans le comportement des cellules simples qui aurait autrement été raté à l’aide de tests basés sur la population. Nous décrivons ici les protocoles d’imagerie de cellules vivantes pour évaluer les décisions de sort de cellule après un traitement par le paclitaxel drogue anti mitotique. Nous démontrons que des méthodes pour visualiser si mitotiquement arrêté cellules meurent directement à partir de la mitose ou retomber dans interphase. On décrit aussi comment le système d’indicateurs (FUCCI) axée sur l’ubiquitination fluorescent de cycle de cellules permet d’évaluer la fraction des cellules en interphase né de glissement mitotique qui sont capables de rentrer dans le cycle cellulaire. Enfin, les auteurs décrivent une méthode d’imagerie de cellules vivantes pour identifier des événements de rupture de membrane nucléaire.
Introduction
Les médicaments anti-mitotiques ont longtemps été utilisés dans les schémas de chimiothérapie de divers types de tumeurs solides et font souvent preuve d’efficacité grande1,2,3. Mécaniquement, ces médicaments perturbent la progression mitotique normale et promouvoir l’arrêt mitotique en prolifération rapide des cellules de cancer. Toutefois, le sort de la cellule en réponse à l’arrêt mitotique est très variable : alors qu’une fraction des cellules subit une mort cellulaire directement à partir de la mitose, d’autres quitter mitose et reprendre l’interphase comme cellules tétraploïdes (un processus appelé glissement mitotique)4, 5,6,7,8. Ces cellules en interphase peuvent exécuter l’apoptose, subissent une arrestation de cycle de cellules permanentes ou même réintègre le cycle cellulaire4,5,6,7,8,9 ,10,11. Les cellules qui se soustraire à la mort cellulaire mitotique en glissant en interphase, seulement à réintègre le cycle cellulaire après le retrait de la drogue, peuvent donc contribuer à la ré-émergence de populations de cellules de cancer. En outre, les cellules que bordereau de mitose sont tétraploïdes et tétraploïdie est connu pour favoriser l’instabilité chromosomique qui alimente la tumeur rechutent12,13,14,15. Il est donc essentiel d’optimiser la thérapeutique actuelle de définir les facteurs qui contrôlent le destin cellulaire en réponse aux traitements médicamenteux anti mitotique.
Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes pour directement observer et étudier le sort des cellules subissant prolongée arrêt mitotique en réponse au paclitaxel drogue anti mitotique. Le paclitaxel est un établi thérapeutique à la clinique et s’est avéré très efficace dans de nombreux types de tumeurs, y compris ceux du sein, ovaires et les poumons16,17,18,19, 20. Paclitaxel, qui est un alcaloïde de la plante provenant de l’écorce de l’if, stabilise les microtubules et empêche donc leur dynamicité21,22. Tandis que l’amortissement de la dynamique des microtubules par paclitaxel n’affecte pas la progression du cycle cellulaire de G1 G2, le médicament mène à une activation soutenue du point de contrôle assemblage du fuseau pendant la mitose en empêchant pièce jointe microtubules kinétochores (revu en profondeur ici23,24)25. En conséquence, apparition de l’anaphase est empêchée dans les cellules traitées au paclitaxel et entraîne un arrêt mitotique prolongé.
Ce protocole décrit tout d’abord des approches afin d’identifier les cellules mitotiques dans des expériences d’imagerie de cellules vivantes. La mitose peut être visualisée dans les cellules adhérentes de vitroplants en raison de deux changements biologiques cellulaire notable. Tout d’abord, chromosomes deviennent très condensées immédiatement avant la rupture de l’enveloppe nucléaire. Alors que souvent détectables par microscopie à contraste de phase standard, condensation des chromosomes peut être détectée de plus clairement à l’aide de fluorescent tags cette étiquette de chromosomes (par exemple des protéines histones fluorescent marqué). Deuxièmement, mitotiques des cellules peuvent également être identifiés par les changements morphologiques dramatiques qui résultent de l’arrondi de la cellule.
Ce protocole sera alors démontrer comment utiliser des méthodes d’imagerie de cellules vivantes pour suivre le destin de l’expérience prolongée arrêt mitotique des cellules. Arrêté lors de la mitose des cellules subissent un des trois moires distincts. Tout d’abord, les cellules peuvent subir la mort cellulaire au cours de la mitose. Ce phénomène est facilement visualisé au microscope photonique, comme les cellules mourantes sont observées à rétrécir, cloque ou rupture. En second lieu, les cellules peuvent sortir de la mitose et retour retour à interphase sans ségrégation des chromosomes ou cytocinèse, un processus appelé glissement mitotique. La décondensation des chromosomes et/ou l’aplatissement de la mitose cellulaire facilement identifie ce processus. Les cellules qui glissent de mitose présentent aussi souvent des noyaux irréguliers, polylobé et hébergent fréquemment plusieurs micronoyaux5. En troisième lieu, arrêtés lors de la mitose des cellules peuvent initier l’anaphase et procéder par mitose, après un long délai. Bien que rare à des concentrations plus élevées, ce comportement suggère que les cellules arrêtées peuvent ont convaincu le poste de contrôle de l’Assemblée du fuseau, ou que le point de contrôle de l’Assemblée de broche est partiellement affaibli ou défectueux. Apparition de l’anaphase peut être visualisée par la ségrégation des chromosomes et la cytokinèse ultérieure en utilisant l’imagerie de cellules vivantes.
Méthodes d’imagerie de cellules vivantes pour suivre le destin des cellules qui se soustraire à la mort cellulaire mitotique en subissant le glissement mitotique seront également décrits. Cellules qui subissent une mitose glissement soit mourir dans l’interphase ultérieur, déclenchent un arrêt du cycle cellulaire de1 G durable ou réintègre le cycle cellulaire pour lancer un nouveau cycle de division cellulaire4. On décrira une approche utilisant le système de FUCCI (indicateur de cycle de cellules fluorescentes axée sur l’ubiquitination) afin de déterminer la fraction des cellules qui réintègre le cycle cellulaire suite à glissement mitotique. FUCCI permet la visualisation directe de la transition / s1G et peut être utilisé en conjonction avec à long terme vivent-imagerie cellulaire in vitro et in vivo26,27. Le système FUCCI profite de deux protéines fluorescent étiquetés, formes tronquées de hCdt1 (licences de la chromatine et la réplication de l’ADN facteur 1) et hGeminin, dont les niveaux oscillent selon position du cycle cellulaire. hCdt1 (fusionné à une protéine fluorescente rouge) est présente à des niveaux élevés au cours de la phase1 de G où il agit pour la réplication d’ADN, mais est ubiquitinée par l’ubiquitine ligase E3 EFCSkp2 et dégradée phases S/G2/m afin d’éviter re-réplication de l’ADN,26. Par contre, hGeminin (fusionné à une protéine fluorescente verte), est un inhibiteur de la hCdt1 dont le sommet niveaux pendant S/G2/m, mais est ubiquitinée par l’ubiquitine ligase E3 APCCdh1 et dégradé à la fin de la mitose et tout au long de G1 26. en conséquence, FUCCI offre une lecture de fluorescence directe de la phase du cycle cellulaire, les cellules présentent une fluorescence rouge au cours de la fluorescence de1 et vert G pendant S/G2/m. Le système FUCCI est une avancée significative sur les autres modes (par ex. bromodéoxyuridine coloration) pour identifier les cellules prolifératives, car elle ne nécessite pas de fixation de la cellule et permet pour l’imagerie de la cellule unique sans la nécessité d’autre pharmacologique traitements de synchroniser des populations cellulaires. Bien que non mentionné dans le présent protocole, des capteurs supplémentaires de cellules vivantes ont été élaborés afin de visualiser la progression du cycle cellulaire, dont un capteur helicase B pour G128, DNA ligase-DP29 et capteurs30 PCDNA-GFP pour la phase S et le capteur de FUCCI-4 récent, qui détecte tous les stades du cycle cellulaire31.
Enfin, une méthode d’imagerie de cellules vivantes pour détecter la rupture de l’enveloppe nucléaire est décrites. Des études récentes ont révélé que les enveloppes nucléaires des cellules cancéreuses sont instable et sujette à craquer, permettant ainsi le contenu du nucléoplasme et cytoplasme de mélanger. Ce phénomène, appelé rupture nucléaire, peut favoriser des lésions de l’ADN et la stimulation de la réponse immunitaire innée32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. les causes de rupture nucléaire restent incomplètement caractérisées, mais on sait que les déformations de la structure nucléaire sont en corrélation avec une augmentation de l’incidence de rupture nucléaire42. Un effet bien connu de traitement de paclitaxel est la génération de structures nucléaires remarquablement anormales après la mitose ; par conséquent, une méthode utilisant l’imagerie de cellules vivantes pour quantifier la rupture nucléaire sera décrite, tout en explorant si traitement de paclitaxel augmente la fréquence des phénomènes de rupture nucléaire. Rupture nucléaire peut être détectée par les fuites observées d’une protéine fluorescente nucléaires ciblées dans le cytoplasme (p. ex. un dimère de tandem repeat de DP fusionné à un signal de localisation nucléaire, TDRFP-NLS). Cette fuite est distinctement visible par le œil, ce qui permet un dosage simple des événements de rupture.
Ce protocole requiert un microscope à épifluorescence widefield qui est équipé d’une scène encodée et logiciel de mise au point automatique. La scène codée permet un mouvement automatisé précis pour la définition des coordonnées X-Y, autofocus logiciel conservant les cellules en bref pour la durée de la période d’imagerie. En outre, ce protocole requiert des équipements à maintenir les cellules à 37 ° C avec humidifiée 5 % CO2 atmosphère. Ceci peut être réalisé en plaçant le microscope ensemble dans une température et d’atmosphère contrôlée enceinte, ou en utilisant des appareils de scène-haut que localement maintient la température et l’environnement. L’objectif de contraste de phase utilisé dans le présent protocole est un fluor plan 10 x avec une ouverture numérique de 0,30. Cependant, 20 X objectifs sont également suffisants pour identifier les deux cellules en interphase arrondie de mitotiques et aplati en un seul plan focal. Si vous effectuez le contraste de phase d’imagerie (comme décrit dans cette méthode), la couverture peut être soit de verre ou de plastique. Si la microscopie en contraste (DIC) d’interférence différentielle est utilisé, il est impératif d’utiliser un couvercle en verre pour prévenir une dépolarisation de la lumière.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’aspect le plus important de l’imagerie de cellules vivantes à long terme est d’assurer la santé des cellules étant imagé. Il est essentiel que les cellules soient exposés à minimales stresseurs environnementaux extérieurs, tels que des conditions non conformes aux normes concernant l’humidité, de température et/ou de CO2 niveaux. Il est également important de limiter le photovieillissement d’éclairage fluorescent d’excitation, comme l’imagerie stress est connu pour affecter la cellul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AFB, VMR et NJG voudrais remercier Ryan Quinton pour commentaires sur le manuscrit et Adrian Salic pour la construction de TDRFP-NLS. AFB et VMR sont financés par la subvention de formation en pharmacologie NIGM biomoléculaire 5T32GM008541. NJG est membre du Shamim et Ashraf Dahod Breast Cancer Research Laboratories et bénéficie de subventions de NIH GM117150 et CA-154531 la Karin Grunebaum Foundation, le programme de bourses de famille Smith, le programme des boursiers Searle et la recherche de mélanome Alliance.
Materials
| phenol red-free, DMEM:F12 media | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| 12-well glass bottomed imaging dish | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Environmental Chamber | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisherbrand | 05-539-12 | |
| 10 cm polystyrene tissue culture plates | Falcon | 08772E | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Fisherbrand | 4488 | |
| 5804R 15 amp Centrifuge | Eppendorf | 97007-370 | |
| 1000 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| 20 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| p1000 Pipette Tips | Sharp | p1126 | |
| p20 Pipette Tips | Sharp | P1121 | |
| RPE-1 Cells | ATCC | CRL-4000 | |
| Incubator Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipette Boy | Integra | 156401 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging | Micro Video Instruments, Inc. | MEA53100 | |
| Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H117P1N4 | |
| Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H31XYZE | |
| Andor Digital Camera | Micro Video Instruments, Inc. | D10NLC | |
| Nikon NIS Elements AR Software | Micro Video Instruments, Inc. | MQS31000 | |
| SOLA LED Illuminator for Fluorescence | Micro Video Instruments, Inc. | SOLA-E | |
| InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control | Micro Video Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece | Micro Video Instruments, Inc. | MEP59391 | |
| Ti-C System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL51000 | |
| Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL56200 | |
| Te-C LWD Ph1 Module | Micro Video Instruments, Inc. | MEH41100 | |
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | MRH10101 | |
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective | Micro Video Instruments, Inc. | MRH48230 |
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