Summary
Questo articolo viene descritto un metodo di microarray della proteina semplice per profilatura risposte immunitarie umorali a un panel 7-plex di altamente purificata antigeni di Clostridium difficile in sieri umani. Il protocollo può essere esteso per la determinazione della risposta di anticorpo specifico nelle preparazioni a base di immunoglobuline policlonali.
Abstract
Forniamo una panoramica dettagliata di un'analisi di microarray di romanzo della proteina ad alta produttività per la determinazione di anti -Clostridium difficile livelli di anticorpi nel siero umano e in preparazioni separate di policlonale dell'immunoglobulina endovenosa (IVIg). Il protocollo descrive i passaggi metodologici coinvolti nella preparazione del campione, stampa delle matrici, procedura di dosaggio e analisi dei dati. Inoltre, questo protocollo potrebbe essere ulteriormente sviluppato per incorporare diversi campioni clinici tra cui plasma e surnatanti di cella. Vi mostriamo come microarray della proteina può essere utilizzato per determinare una combinazione di isotipo (IgG, IgA, IgM), sottoclasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) e ceppo-specifici anticorpi altamente purificato tutta c. difficile tossine A e B (toxinotype 0, ceppo VPI 10463, ribotipo 087), la tossina B da un c. difficile tossina B-sola espressione ceppo (CCUG 20309), una forma di precursore di un frammento di B della tossina binaria, pCDTb, proteine di tutta la superficie strato ribotipo-specifico (SLPs; 001, 002, 027) e proteine (tetano di controllo tossoide tetanico e Candida albicans). Durante l'esperimento, microarrays sono sondati con i sieri da individui con l'infezione di c. difficile (CDI), gli individui con fibrosi cistica (CF) senza diarrea, controlli sani (HC) e da individui pre- e post-IVIg terapia per la trattamento di CDI, immunodeficienza combinata disordine e Poliradicolite demielinizzante infiammatoria cronica. Incontriamo differenze significative nei livelli di anticorpo specifico multi-isotipo di efficacies di neutralizzazione della tossina e tra gruppi di pazienti, preparazioni commerciali di IVIg e la sera prima e dopo somministrazione di IVIg. Inoltre, c'è una correlazione significativa tra microarray e analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) per i livelli di IgG antitossina in campioni di siero. Questi risultati indicano che microarray potrebbe diventare uno strumento promettente per profilatura risposte anticorpali agli antigeni di C.difficile in esseri umani infettati o vaccinati. Con ulteriore affinamento dei pannelli di antigene e una riduzione dei costi di produzione, possiamo anticipare che la tecnologia microarray può aiutare ottimizzare e selezionare i più clinicamente utile immunoterapie per infezione da c. difficile in modo specifico per ogni paziente.
Introduction
Questo protocollo descrive lo sviluppo e la convalida di un'analisi di microarray della proteina di romanzo e su misura per il rilevamento e semi-quantificazione del ceppo batterico e le risposte specifiche dell'isotipo dell'anticorpo agli antigeni di c. difficile . Utilizziamo con successo la nostra difficile del c.-analisi di microarray specifici come un promettente nuovo strumento per la bioanalysis compositiva del contenuto di anticorpi specifici nei sieri dei pazienti1,2, preparazioni di IVIg3, e identificazione delle specificità dell'anticorpo che correlano con i risultati difficili in CDI4. Dimostriamo come campioni di siero biobanked e preparazioni commerciali di IVIg possono essere analizzate su diapositive di microarray, che permette alta qualità riproducibile profilatura delle risposte di agente patogeno specifico anticorpo di c. difficile in questo test.
Molti bambini sani e adulti hanno anticorpi IgG e IgA siero rilevabile c. difficile tossine A e B5,6. Questi sono pensati per risultare a seguito di esposizione transitoria durante l'infanzia e dopo esposizione a c. difficile in età adulta. Per questo motivo, policlonali IVIg è stato utilizzato off-label per il trattamento sia ricorrente e fulminante CDI7,8,9. Tuttavia, il suo ruolo definitivo e modalità di azione rimane poco chiaro. Parecchi studi hanno indicato che la risposta immunitaria umorale alle tossine di c. difficile svolge un ruolo nella presentazione della malattia e nel risultato. In particolare, i pazienti asintomatici mostrano una concentrazione aumentata del siero anti-tossina A IgG rispetto ai pazienti che sviluppano la malattia sintomatica10. Un'associazione dimostrabile è stata segnalata per i titoli di IgG A di mediano anti-tossina e mortalità per qualsiasi causa 30 giorni11. Parecchi rapporti hanno rivelato anche un'associazione con una protezione contro le risposte di ricorrenza e l'anticorpo per la tossina A, B e diversi antigeni non-tossina (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD e proteine di strato di superficie (SLP))12,13 , 14 , 15. queste osservazioni hanno stimolato lo sviluppo del primo immunoterapia passiva drug targeting c. difficile tossina B (bezlotuxumab), che è stato recentemente approvato dalla US Food and Drug Administration e l'Agenzia europea dei Agenzia per la prevenzione di ricorrenti CDI16. Strategie vaccinali utilizzando le tossine inattivate o frammenti di tossina ricombinante sono inoltre attualmente in sviluppo17,18,19. Questi nuovi approcci terapeutici senza dubbio stimolerà il requisito per valutare le risposte immunitarie umorali agli antigeni multipli in campioni di grandi dimensioni.
Oggi, c'è una notevole mancanza di saggi ad alta velocità disponibile in commercio in grado di valutare contemporaneamente il ceppo batterico e le risposte specifiche dell'isotipo dell'anticorpo agli antigeni di c. difficile . C'è un bisogno insoddisfatto per sviluppare tali dosaggi per facilitare gli sforzi di ricerca futura e applicazioni cliniche. Microarrays della proteina sono un metodo per immobilizzare un numero elevato di proteine purificate individualmente come matrice spazialmente organizzata dei punti su una superficie basata su vetrino al microscopio utilizzando un sistema robotico, che può essere un contatto20 o un non-contatto stampa strumento21. Le macchie possono rappresentare miscele complesse come lisati cellulari, anticorpi, omogenati, proteine endogene o ricombinante o peptidi, fluidi corporei o farmaci22,23.
Tecnologia di microarray della proteina offre chiari vantaggi rispetto a standard in-House ELISA tecniche, che sono stati tradizionalmente usati per valutare le risposte di anticorpi di anti -c. difficile . Questi includono una maggiore capacità per la rilevazione di una gamma di multi-specifici anticorpi contro un pannello più ampio di bersagli proteici, requisiti di volume ridotto per gli antigeni, campioni e reagenti e una maggiore capacità di incorporare una più grande numero di repliche tecniche, oltre a controllo di qualità interno multiple (QC) misura1. I microarrays sono quindi più sensibile, accurato e riproducibile e hanno una maggiore gamma dinamica. Questi fattori rendono i microarrays un'alternativa più conveniente e potenzialmente favorevole a Elisa per la rilevazione su larga scala di proteine note. Tuttavia, gli svantaggi della tecnologia microarray dovuti principalmente i grandi costi iniziali associati che istituisce un pannello di antigeni altamente purificati e la creazione della piattaforma tecnologica.
Microarrays della proteina sono stati ampiamente utilizzati negli ultimi due decenni come strumento di ricerca diagnostica di base in applicazioni cliniche. Applicazioni specifiche includono l'espressione della proteina di profilatura, lo studio delle relazioni di enzima-substrato, lo screening biomarcatore, analisi delle interazioni ospite-microbo e profilatura anticorpo specificità23,24, 25,26,27,28. Molti nuovo agente patogeno/antigene della proteina microarrays sono stati stabiliti, tra cui la malaria (Plasmodium)29, HIV-130, riossidazione31, sindrome respiratoria acuta grave (SARS)32, febbre emorragica virale33 , herpesvirus34e35di tubercolosi.
Il presente protocollo si riferisce all'istituzione di un facile funzionamento C. difficile reattiva dosaggio dell'antigene microarray, che consente la quantificazione precisa e specifica di multi-isotipo e le risposte dell'anticorpo specifico ceppo di C. difficile antigeni nel siero e policlonale IVIg. Nel presente documento, includiamo risultati rappresentativi relativi ad una prestazione di analisi di microarray di accettabile rispetto a ELISA così come dosaggio precisione e riproducibilità profili. Questo test potrebbe essere ulteriormente sviluppato per profilare altri campioni clinici e stabilisce un nuovo standard per la ricerca della base molecolare della CDI.
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Protocol
1. preparazione di un piatto di Microarray
- Diluire gli antigeni di c. difficile con un buffer di stampa [PBS-Tween-trealosio (50mm)] alla concentrazione ottima (che è stata predefinita prima di eseguire i sieri dei pazienti): tossina A (200 µ g/mL) e tossina B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL) e nativo purificato SLPs tutta derivata da ribotypes 001, 002 e 027 (200 µ g/mL).
Nota: La tossina B è stata ottenuta da una tossina B-esprimendo ceppo CCUG 20309 (90 µ g/mL).- Diluire i controlli positivi, lisati di albicans del c.e tossoide tetanico con il buffer di stampa a 100 µ g/mL. Infine, diluire l'immunoglobulina umana purificata matching l'isotipo dell'anticorpo testati in serie, a partire da 50 µ g/mL in tutto 10 diluizioni nel buffer di stampa per creare una curva di calibrazione.
- Trasferire 10 µ l delle diluizioni nel buffer di stampa in una piastra 384 pozzetti.
- Coprire la piastra con un sigillo di piastra e centrifugare a 300 x g per 5 min.
2. stampa matrici con un Robot contatto
- Calore il perno di silicio con il bruciatore a gas portatile 3 x 2 s ogni e sciacquare in acqua pulita 3x3 s ciascuno.
- Posizionare la piastra di microarray nella cartuccia caricamento della arrayer.
- Porre i vetrini inibitori sulla barra di scorrimento.
Nota: Il vassoio di diapositiva può contenere 27 diapositive: tre righe di nove diapositive. Le diapositive sono disposte in verticale a partire dal lato sinistro della riga inferiore e il resto degli spazi sono coperti con diapositive vuote per garantire che tutti i fori sul vassoio scorrevole sono coperti.- Premere OK e verificare che un vuoto è stato acceso e tutte le diapositive sono sicure. Lasciare le diapositive in ambiente umido per almeno 1 h prima di iniziare la stampa.
Nota: Le diapositive di inibitori sono disponibili in una confezione sigillata con essiccante. Una volta aperto, tutte le diapositive non utilizzate devono essere restituite immediatamente nell'essiccatore per deposito fino alla data di scadenza.
- Premere OK e verificare che un vuoto è stato acceso e tutte le diapositive sono sicure. Lasciare le diapositive in ambiente umido per almeno 1 h prima di iniziare la stampa.
- Impostare il programma di stampa adatto per stampare gli antigeni di Clostridium difficile . Lanciare la Suite di applicazioni di TAS e aprire il file di parametri di esecuzione stampa richiesti dalla directory 'My Gridding corre'. Selezionare file di Clostridium difficile per la stampa di tutti gli antigeni di Clostridium difficile in quadruplice copia.
- Al momento facendo doppio clic sull'icona di MicroArray nella finestra principale verrà visualizzata una finestra di tre-a schede chiamato 'MicroArraying parametri'. Le tre schede sono "Fonte", "Target" e "Opzioni". La scheda "Origine" Mostra dettagli il numero di campioni utilizzati nella piastra di microarray. La scheda di "Target" Mostra i dettagli di come le diapositive devono essere caricati, dove la matrice deve essere stampato sulla diapositiva e modificare il layout della diapositiva (16 sottomatrice formati). La scheda "Opzioni" Mostra dettagli del protocollo di lavaggio e strumento per essere usato per esempio. lavare dopo ogni campione completato. Pulire il perno di silicio tra campioni per evitare qualsiasi contaminazione incrociata tra diversi campioni.
- Le opzioni di programmazione si trovano in Opzioni > Preferenze eseguire sulla barra TAS Application Suite. Ci sono 9 schede di lavorare attraverso in questa sezione e come si completa una scheda spostarsi al successivo facendo clic su di esso. Cliccando il pulsante "OK" vi porterà fuori "Esegui preferenze". Nella scheda "Generale" delle preferenze"Run", ci sono un numero di caselle di controllo disponibili in questa sezione relativa a come lo strumento si comporterà quando un programma viene avviato. Selezionare la casella di "Bagno primo prima di inizio di esecuzione", tutte le stazioni di lavaggio tre subirà una sequenza breve innesco prima dell'inizio di esecuzione. Seleziona la casella "Lavare a inizio di esecuzione", lo strumento perno sarà lavato prima di visitare la prima fonte. Spunta la casella "Wash al termine della corsa", lo strumento perno sarà lavato dopo l'origine Ultima visita. L'utente può impostare il numero di cicli di lavaggio. Nella scheda "Clima" delle preferenze"Run", avviare l'umidificazione. L'impostazione che usiamo sono come segue: avviare tasso 55%, eseguire tasso 55%, umidità minima 55%, destinazione umidità 60%. Non avviare l'esecuzione fino a quando viene raggiunta l'umidità di destinazione, altrimenti le macchie saranno la taglia sbagliata e la libreria evaporano rapidamente.
- Nella barra menu di TAS, fare clic sul pulsante verde vanno. Avviare l'esecuzione e osservare periodicamente arrayer durante la tiratura per essere certi che tutto è OK.
Nota: In questo modo l'analisi di 15 campioni in parallelo su ogni diapositiva come una sottomatrice viene utilizzato come controllo negativo. Il design delle sottomatrici è determinato dal numero delle proteine stampate (antigeni) e il numero del biologico stampato replica.
Nota: Dopo la stampa di ogni campione, la testa si muove verso le vasche di lavaggio per consentire più immersione del perno in due vasche di lavaggio contenente acqua distillata e 0,002% Tween 20 per 1.5 s in ogni bagno, seguita da risciacquo il perno con acqua ultra-pura e asciugatura il pin in la stazione di lavaggio principale per 4 s.
3. stoccaggio delle matrici
- Mantenere le diapositive stampate immagazzinate durante la notte a temperatura ambiente in un essiccatore.
Nota: Le diapositive stampate possono essere memorizzate fino a una settimana.
4. matrice di sondaggio
- Posizionare delicatamente diapositive stampate in un supporto per diapositive di formato di 16 camere multi-pozzetto.
Nota: Le camere, con una profondità di circa 7,5 mm, forniscono una generosa superficie in rapporto al volume per facilitare la miscelazione e fasi di lavaggio. - Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente prima dell'uso. Se non specificato diversamente, eseguire le seguenti operazioni a temperatura ambiente.
- Aggiungere 100 µ l di filtrato interpolazione di 5% di albumina di siero bovino (BSAT; uso una siringa filtro 0,2 µm) per ogni blocco, coprire le diapositive e li incubare con agitazione per 1 h.
- Lavare i vetrini 5 x 1 min ciascuno in 120 µ l di tampone fosfato salino con Tween 20 (PBST; 0,1% Tween) per pozzetto con agitazione. Le diapositive non lasciare asciugare.
- Scongelare i campioni di siero in ghiaccio per 20 minuti e diluire ogni campione con un anticorpo commercialmente disponibile diluente con sfondo riducendo la componente (Vedi Tabella materiali).
- Ottimizzare la diluizione dei campioni secondo la testata dell'immunoglobulina del siero come mostrato nella tabella 2.
- Trasferire 100 µ l dei campioni siero diluito a tutti i blocchi tranne uno, che sarà utilizzato come controllo negativo; a questo blocco, aggiungere 100 µ l di anticorpo diluente solo. Incubare i vetrini con delicata agitazione per 1 h.
- Lavare i vetrini 5 x 3 min ciascuno in 120 µ l di PBST (0.1% Tween) per pozzetto con agitazione.
- Aggiungere 100 µ l di un anticorpo anti-umano di biotinylated capra diluito con diluente dell'anticorpo.
- Ottimizzare la diluizione dell'anticorpo secondario secondo l'immunoglobulina testato come descritto nella tabella 2. Coprire i vetrini e li incubare con agitazione delicata per 1 h.
- Lavare i vetrini 5 x 3 min ogni 120 µ l di PBST con agitazione.
- Aggiungere 100 µ l di streptavidina Cy5 a ogni blocco diluito a 1: 2000 in 5% BSA. Coprire i vetrini con un foglio per proteggerli dalla luce mentre agitando per 15 minuti con agitazione delicata.
- Lavare i vetrini 5 x 1 min ciascuno in 120 µ l di PBST per pozzetto con agitazione, seguita da 2 lavaggi di 1min ogni in PBS solo con agitazione.
- Girare le diapositive per 5 min a 300 x g per asciugarle.
- Tenere i vetrini in una scatola scuro per trasporto e stoccaggio a temperatura ambiente.
- Procedere alla scansione delle matrici immediatamente per garantire la coerenza del segnale dopo il sondaggio.
Nota: Tuttavia, sondati diapositive possono essere conservati al buio e analizzati entro una settimana dal sondaggio.
5. scansione delle matrici
- Accendere il laser scanner (Vedi Tabella materiali) 30 min prima della scansione per scaldare il laser. Caricare il software dello scanner e collegare il computer allo scanner.
- Inserire una diapositiva con il lato stampato verso l'alto nello scanner fino a quando la riproduzione della luce diventa verde fisso.
- Premere il pulsante Impostazioni e modificare le seguenti impostazioni durante la scansione le diapositive come segue: modalità di scansione, mediana; Acquisizione, 635 solo; Modalità di acquisizione, manuale; Guadagno, 20; Potenza, basso; Tipo di diapositiva, diapositiva senza etichetta; Messa a fuoco, messa a fuoco automatica. Disattivare lo scorrimento automatico e impostare Barcode Reading Pixel dimensioni 10 e 35 Scan.
- Salvare le immagini risultanti come 16-bit scala di grigi più il formato immagine TIFF. Premere il pulsante di Importazione griglia e selezionare l'elenco di matrice appropriata.
Nota: L'elenco di matrice descrive le dimensioni e la posizione delle sottomatrici e i nomi delle sostanze stampate associate a ciascun indicatore di funzione.- Allineare la griglia per le macchie sulla diapositiva.
- Analizzare le immagini premendo il pulsante di processo di quantificazione per misurare l'intensità del segnale di fluorescenza di ogni spot e salvare i risultati in un formato di testo chiamato GenePix risultati (GPR).
Nota: Il file GPR contiene le variabili di localizzazione e identificazione degli obiettivi dell'antigene sulla matrice e anche l'intensità della fluorescenza mediano e lo sfondo locale che rappresenta l'associazione di anticorpo segnalare valori di ogni spot.
6. analisi dei dati
- Calcolare la mediana per le repliche di ogni antigene dopo la sottrazione di sfondo utilizzando un software di analisi di microarray gratuito chiamato analizzatore di fase inversa proteina matrice (RPPA), un modulo all'interno del linguaggio statistico R su CRAN36.
- Tracciare la curva standard e interpolare i segnali di ogni antigene rispetto alla curva standard di immunoglobulina utilizzo commerciale grafica scientifica e software di statistiche (Vedi Tabella materiali) per calcolare i livelli dell'anticorpo.
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Representative Results
La figura 1 illustra un diagramma di flusso che descrive i passaggi principali del protocollo descritto. La figura 2 Mostra il test di correlazione di Spearman dimostrando significativo accordo tra microarray ed ELISA per IgG e IgA anti-tossina A e B livelli in sieri paziente. La figura 3 Mostra differenziale IgG e IgA anticorpi-classe risposte anticorpali specifici per la tossina A, B, binario tossine e (pCDTb) in pazienti con i CF senza diarrea, CDI pazienti con diarrea e in HC. La figura 4 Mostra l'antitossina di c. difficile neutralizzare le risposte dell'anticorpo nel siero dei pazienti. La figura 5 Mostra la reattività immune (contro le tossine di c. difficile e SLPs) e l'effetto neutralizzante (contro le tossine di c. difficile ) di IVIg. Figura 6 Mostra la reattività immune (contro le tossine di c. difficile e SLPs) e l'effetto neutralizzante (contro le tossine di c. difficile ) dei sieri dei pazienti pre- e post-IVIg amministrazione. La tabella 1 Mostra accettabili coefficienti intra - e inter - analisi della variabilità di microarray utilizzando sieri di prova. La tabella 2 illustra un elenco delle immunoglobuline utilizzate in questo studio con rilevanti concentrazioni di proteine purificate, come pure le diluizioni ottimizzati per sieri e anticorpi secondari.
Figura 1 : Panoramica generale dei principali passaggi necessari per il protocollo microarray. Il primo passo è la preparazione dei controlli e gli antigeni. Le diluizioni del campione successive vengono trasferite ad una piastra di 384 in preparazione per la stampa in quadruplicato sulle diapositive di inibitori. A seguito di essiccazione e di blocco di diapositive, le matrici vengono incubate con sieri dei pazienti. Dopo ulteriore lavaggio, viene aggiunto l'immunoglobulina anti-umano di biotinylated (Ig) dell'isotipo specificato. Dopo il lavaggio finale e asciugatura passaggi, le diapositive vengono analizzate e le risultanti immagini elaborate con un software di analisi di immagine di microarray. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Correlazione fra microarray ed ELISA risultati. Il coefficiente di correlazione di Spearman è stato utilizzato per valutare il livello di accordo tra le due piattaforme. Quando si confrontano le prestazioni di microarray con un in-House enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA), A. un buon coefficiente di correlazione è stato osservato per la tossina A (r = 0.7051; P < 0,0001), B. e una moderatamente buona correlazione per la tossina B (r = 0.5809; P < 0,0001). Il protocollo completo di ELISA è stata dettagliata altrove37. Questa figura è stata ristampata da Negm et al. 1 con il permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: risposte anticorpali specifici per Clostridium difficile tossine. Questa immagine semina il siero anti-tossina IgG e IgA responses (toxinotype 0, ceppo VPI 10463, ribotipo 087; tossina A 200 µ g/ml, la tossina B a 100 µ g/mL), la tossina B (tossina dic. difficile sforzo diproduzione su B CCUG 20309; tossina B 90 µ g/ml) e la forma di precursore di una B frammento della tossina binaria, pCDTb (200 µ g/mL), in pazienti con fibrosi cistica (CF) senza diarrea, pazienti con infezione da c. difficile (CDI) con diarrea e nei comandi sani (HC). La diluizione del siero per IgG e IgA sono 1: 500 e 1: 100, rispettivamente. Le differenze fra i gruppi sono state valutate utilizzando il test di Kruskal-Wallis, seguito dal test post-hoc di Dunn per risposte multiple. Confrontato con l'HC (n = 17) e i pazienti con sintomatico CDI (n = 16), i pazienti CF adulti (n = 16) hanno esibito i livelli elevati significativamente del siero IgA anti-tossina A e B livelli; P ≤ 0.05. Lo stesso schema è prevalso per IgG, tranne per il fatto che non c'era differenza nei livelli A IgG anti-tossina fra i gruppi. Le trame casella e Baffo rappresentano la mediana, gamma e quartili. P ≤ 0.0001; P ≤ 0,01; P ≤ 0.05. I segnali standardizzati sono normalizzati a curva standard dell'immunoglobulina. Questa figura è stata ristampata da Monaghan et al. 2 con autorizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: efficacies anticorpo neutralizzante per c. difficile tossine A e B nei sieri dei pazienti. Questa figura mostra l'anticorpo neutralizzante protettivo (NAb) risposte a c. difficile tossine A e B [toxinotype 0, ceppo VPI 10463, ribotipo 087, utilizzato ad una dose letale 50% (LD50)] nei sieri (diluizione 1: 100; tossina A 2,5 ng/mL, la tossina B 0,5 ng/mL) da HC , i pazienti con i CF senza diarrea e i pazienti con CDI con diarrea. I sieri da pazienti CF hanno esibito significativamente più forte protezione anti-tossina NAb le risposte rispetto con i sieri da HC (tossine A e B) e dai pazienti con CDI (tossina A). Le differenze fra i gruppi sono state valutate utilizzando il test di Kruskal-Wallis, seguito dal test post-hoc di Dunn per risposte multiple. Le trame casella e Baffo rappresentano la mediana, gamma e quartili. P ≤ 0,01; P ≤ 0.05. Questa figura è stata ristampata da Monaghan et al. 2 con autorizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Reattività immune e neutralizzare l'effetto di IVIg per gli antigeni C.difficile . R. questa immagine mostra la reattività del multi-isotipo di specifici anticorpi agli antigeni di c. difficile nelle preparazioni commerciali dell'immunoglobulina endovenosa (IVIg). La mappa di calore illustra i livelli di isotipi di anticorpo specifico (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 e IgM) in tre preparazioni disponibili nel commercio (Vedi Tabella materiali) contro gli antigeni di c. difficile sette [tossina un (200 µ g /mL), tossina B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL), la tossina B (CCUG 20309; 90 µ g/mL) e proteine (SLPs) 001, 002 e 027 (tutti i 200 µ g/mL) di strato di superficie] utilizzando la tecnologia di microarray della proteina. Il codice colore della mappa di calore è come segue: verde (basso) al (rosso alta) intensità del segnale. I valori di segnale rappresentati sulla scala dei colori per la mappa di calore sono log2-trasformate dalle unità arbitrarie fluorescenza (AFU). Per favore nota che il AFU più recentemente è stato sostituito dal descrittore standardizzato segnali2. Il totale isotipi di IgG, IgG1 e IgG2 ha dato le più alte reattività associazione contro la tossina A, tossina B, tossina binaria (pCDTb) e la tossina B (CCUG 20309). B. questi grafici mostrano tutta l'efficacia di neutralizzazione di IVIg contro il nativo c. difficile tossine A e B. Ti danno la percentuale dell'effetto protettivo di neutralizzazione dei prodotti IVIg commerciali contro le tossine di c. difficile A e B. Ogni grafico rappresenta la mediana della triplice copia esperimenti alla diluizione 1: 100. Preparazione di IVIg 1 esibisce l'effetto protettivo più basso rispetto alle preparazioni di IVIg 2 e 3, in particolare contro la tossina A. * * * P ≤ 0.0001; P ≤ 0.05 (analisi della varianza unidirezionale). Questa figura è stata modificata da Negm et al. 3 con il permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Reattività immune e neutralizzando l'effetto del siero del paziente al c. difficile antigeni. R. questa figura mostra un confronto di reattività dell'anticorpo contro le proteine di c. difficile in sieri dei pazienti prima e dopo l'infusione di IVIg. La mappa di calore illustra il livello di espressione dei isotipi (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 e IgM) in campioni di siero in sette pazienti prima e dopo l'infusione di IVIg contro gli antigeni di c. difficile sette [tossina A (200 µ g/mL), la tossina B (100 µ g / mL), pCDTb (200 µ g/mL), la tossina B (CCUG 20309; 90 µ g/mL) e SLPs 001, 002 e 027 (tutti i 200 µ g/mL)] utilizzando la tecnologia di microarray della proteina. Il codice colore della mappa di calore è come segue: verde (basso) al (rosso alta) intensità del segnale. I valori di segnale rappresentati sulla scala dei colori per la mappa di calore sono log2-trasformato dalla AFU. Siete pregati di notare che la AFU più recentemente è stato rimpiazzato da segnali standardizzato2. Ci era un aumento post-infusione delle reattività totale di IgG, IgG1, IgG2 e IgG3 la tossina A, tossina B e pCDTb. B. questa immagine mostra le risposte di IgG per la tossina A, tossina B e tossina binaria (pCDTb), pre- e alberino-IVIg amministrazione. I livelli totali di IgG contro tutte le tossine mostrano un aumento significativo in seguito alla somministrazione di IVIg (utilizzando il test di Wilcoxon firmare-allinea). Ogni grafico rappresenta la mediana della triplice copia esperimenti alle 01:10 diluizione. C. questi grafici mostrano l'effetto di neutralizzazione contro nativo c. difficile tossine A e B dopo la somministrazione di IVIg. Un confronto delle attività di anticorpo neutralizzante pre- e post-infusione Mostra un effetto protettivo maggiore dopo le infusioni di IVIg contro il nativo c. difficile tossine A e B. Ogni grafico rappresenta la mediana della triplice copia esperimenti alle 01:10 diluizione. Un aumento significativo nell'effetto protettivo contro le tossine A e B è stato notato nell'infusione di alberino-IVIg sieri dei pazienti testati (utilizzando il test di Wilcoxon firmare-allinea). Questa figura è stata ristampata da Negm et al. 3 con il permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Riproducibilità | Tossina A | Tossina B | SLP001 | SLP002 | SLP027 | Tossina B CCUG 20309 | pCDTb |
| Intra-test | 7.70% | 6,40% | 7,40% | 5.10% | 7,60% | 7% | 3,70% |
| Inter-saggio | 9,10% | 9,10% | 7,40% | 11.20% | 12,8 | 9,70% | 12,50% |
Tabella 1: Microarray precisione intra-saggio ed Inter-saggio 1. variabilità di intra - e inter - analisi di Microarray sono stati calcolati usando i sieri di 7 pazienti. Campioni identici sono stati analizzati su ciascuno dei due scivoli in due punti temporali indipendenti. Tutti gli antigeni (n = 7 test e n = 2 controlli) sono stati avvistati in replicati di cinque su ogni matrice.
| Concentrazione di proteina purificata | Diluizione del siero | Diluizione di anticorpo secondario | |
| IgG | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
| IgG1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgG2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgG3 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgG4 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgA | 50 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgA1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgA2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgM | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
Tabella 2: elenco delle immunoglobuline utilizzate in questo studio. La Igs sono mostrati con le concentrazioni di proteina purificata pertinenti (µ g/mL) e diluizioni di siero e anticorpi secondari.
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Discussion
In questo protocollo, abbiamo dimostrato che microarray è una piattaforma adatta per definire le risposte immunitarie umorali agli antigeni della proteina c. difficile in sieri dei pazienti (figure 3 e 6) e preparazioni commerciali di IVIg (Figura 5). Abbiamo anche dimostrato che la tecnica di microarray esegue anche quando rispetto ai convenzionale ELISA (Figura 2) e Mostra eccellente riproducibilità, con variabilità intra - e inter - analisi che rientrano entro limiti accettabili di precisione ( Tabella 1).
Fasi critiche:
Un numero di passaggi critici deve essere seguito durante la creazione di qualsiasi piattaforma di microarray di successo dell'antigene. Inizialmente, è estremamente importante eseguire esperimenti QC. Negli esperimenti QC, dovrebbero essere valutati diversi parametri, quali la selezione della chimica di superficie appropriata, buffer di stampa, blocco buffer, diluizioni dei campioni del siero e gli anticorpi secondari. Questi esperimenti devono essere eseguiti con l'obiettivo di fornire una tecnica affidabile e ben convalidati38,39.
La selezione di un processo di immobilizzazione di proteine adatto è uno dei passi più importanti nelle analisi di microarray, per garantire una performance di alta qualità delle diapositive inibitori testati, come si è visto in questo studio. È fondamentale osservare la morfologia spot regolare e circolare, specifico e ad alta intensità del segnale e uno sfondo chiaro. Un altro fattore che incidono sulle prestazioni di microarray è il buffer di stampa, che è altrettanto importante raggiungere la chimica di superficie desiderata per produrre macchie uniforme e regolare sulla diapositiva.
È importante selezionare le impostazioni corrette per la stampa in modo che la dimensione ottimale e la forma di un posto per essere stampato. Ad esempio, il livello di umidità dovrebbe essere mantenuto a circa 55% durante la stampa, perché senza umidità è aumentato il tasso di evaporazione nella camera di microarray e meno macchie vengono stampati.
Legame con le proteine non specifiche è un ulteriore fattore che interessa lo sfondo e spot segnali; Pertanto, la selezione appropriata di un tampone bloccante potrebbe ridurre qualsiasi legame aspecifico, portando a una migliore sensibilità e precisione del matrice dati39.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi:
Antigeni e campioni di siero devono essere aliquotati e conservati in piccoli tubi di deposito in freezer fino all'utilizzo, che consente di evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento multipli, che possono peggiorare la potenza del segnale della matrice. Per migliorare le probabilità di un esperimento riuscito, tutti i reagenti devono essere preparati freschi e filtrati. Pulizia il arrayer prima stampa e controllando che le impostazioni sono necessarie. Inoltre, il portavetrini devono essere tenuto pulito per ridurre al minimo il rumore di fondo.
Limitazioni:
L'applicazione di microarrays della proteina è attualmente ostacolata dalla domanda rigorosa sulla chimica di superficie nella fabbricazione di microarray della proteina. Qui la grande variazione nelle proprietà fisiche e chimiche delle molecole della proteina necessita di chimica di superficie unica personalizzato-progettazione per le diverse classi di molecole della proteina e dell'anticorpo40. Altri la diffusa implementazione di tale tecnologia di sfide tecniche comprendono la necessità di costose attrezzature specializzate e software con panca-spazio allocato, come pure la considerazione dei costi di manutenzione, analisi di dati complessi, parente quantificazione della proteina e criticamente ad antigeni purificati.
Significato del metodo rispetto ai metodi esistenti/alternativa:
Tecnologia di microarray è simile in linea di principio a ELISA, individuazione delle scala Meso o Luminex immunodosaggi, ma è personalizzabile, può essere scalata per raggiungere il potere statistico, si basa su microlitro solo quantità di preziosi campioni e ha la capacità di sieri di schermo per più reattività della proteina. Pertanto è particolarmente adatto per le banche del siero su larga scala, storica e scoperta del biomarcatore e lo screening.
Applicazioni future o indicazioni di metodo:
Gli sforzi futuri saranno orientati a ottimizzare il dosaggio per altri campioni (surnatanti delle cellule), facendo uso dell'analisi come strumento prognostico per la stratificazione del paziente, biomarcatori potenziali esternamente convalidare utilizzando larghe coorti in maniera cieca, e previsione e ottimizzazione risposta all'immunoterapia (mAb, vaccini). In futuro, la tecnologia microarray potrebbe essere utilizzata in ambiente ospedaliero come un utile strumento diagnostico o per monitorare un piano di trattamento della droga per un periodo di tempo.
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Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da una borsa di Hermes da Ola Negm e Tanya Monaghan e attraverso finanziamento separato dal centro di malattie Digestive di Nottingham e il NIHR Nottingham digestivi malattie Biomedical Research Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, USA | N/A | Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides. |
| Scanner InnoScan 710. | Innopsys | N/A | A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction. |
| MAPIX software version 7.2.0 | Innopsys | N/A | Measure signal intensities of the spots. |
| Silicon contact pin | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Print the samples onto the slides. |
| Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | To store the new and printed slides. |
| 384-well plate | Genetix | X7022UN | To prepare the antigens. |
| Plate cover | Sigma Aldrich, UK | CLS6570-100EA | To reduce evaporation of the samples. |
| Aminosilane slides | Schott, Germany | 1064875 | The slide of choice for printing the antigens. |
| Slide holders | GraceBio Labs, USA | 204862 | Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . |
| Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Positive control |
| Tetanus Toxoid | Athens Research and Technology | 04/150 | Positive control |
| Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707 | Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-1 | Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-2 | Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-3 | Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-4 | Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. |
| Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701 | Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-1M | Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-2M | Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma. |
| Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090713 | Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma. |
| Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific | Vector Labs | BA-3080 | Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| 0.2 mm syringe filter | Thermo scientific | 723-2520 | Filter the 5% BSA. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Use 5% BSA for blocking the slides. |
| Antibody diluent | Dako, UK | S3022 | To dilute the serum and the secondary antibody. |
| Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Detection of the immune reaction. |
| Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb | University of Bath | NA | Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
| Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins | Dublin City University | NA | |
| Vigam (IVIg preparation 1) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Privigen (IVIg preparation 2) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Intratect (IVIg preparation 3) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A |
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