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Biologia

Protocollo sperimentale per l'utilizzo di Drosophila come sistema modello invertebrati marini per test di tossicità in laboratorio

Published: July 10, 2018
doi:
10.3791/57450
,
1Communities for Building Active STEM Engagement,Colorado State University-Pueblo, 2Department of Biology,Colorado State University-Pueblo

Summary

In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per l’esposizione di specie del genere Drosophila agli inquinanti con l’obiettivo di studiare l’impatto dell’esposizione su una gamma di uscite fenotipiche alle varie fasi di sviluppo e per più di una generazione.

Abstract

Proprietà emergenti e fattori esterni (interazioni livello di popolazione e a livello di ecosistema, in particolare) svolgono i ruoli importanti nel mediare gli endpoint ecologicamente importanti, anche se raramente sono considerati negli studi tossicologici. D. melanogaster sta emergendo come un modello di tossicologia per gli effetti comportamentali, neurologici e genetici di sostanze tossiche, per citarne alcuni. Ancora più importante, può essere utilizzato specie del genere Drosophila come sistema modello per un approccio integrativo framework incorporare le proprietà emergenti e rispondere a domande ecologicamente rilevanti nella ricerca di tossicologia. Lo scopo di questa carta è quello di fornire un protocollo per l’esposizione di specie del genere Drosophila agli inquinanti da utilizzarsi come sistema modello per una gamma di uscite fenotipiche e domande ecologicamente rilevanti. Più specificamente, questo protocollo può essere usato per 1) collegare più livelli biologici di organizzazione e comprendere l’impatto delle sostanze tossiche su entrambi fitness a livello individuale e della popolazione; 2) verificare l’impatto delle sostanze tossiche nelle diverse fasi di esposizione inerente allo sviluppo; 3) prova implicazioni multigenerazionale ed evolutivi di inquinanti; e 4) test di contaminanti e fattori di stress multipli contemporaneamente.

Introduction

Ogni anno, circa 1.000 nuovi prodotti chimici vengono introdotti dalla industria chimica1,2; Tuttavia, l’impatto ambientale di solo una piccola percentuale di questi prodotti chimici è testato prima della distribuzione2,3. Anche se catastrofi su larga scala sono rare, esposizione subletale e cronica per una grande varietà di sostanze inquinanti sono diffuse in entrambi esseri umani e animali selvatici4,5. Al centro storico di ecotossicologia e tossicologia ambientale era quello di testare la letalità, singola esposizione chimica, l’esposizione acuta e gli effetti fisiologici dell’esposizione, come un mezzo per misurare l’impatto degli inquinanti sulla sopravvivenza6, 7 , 8 , 9 , 10. anche se c’è uno spostamento verso approcci etici e non invasiva alla sperimentazione animale, approcci attuali stanno limitando a causa del ruolo che lo sviluppo, proprietà emergenti e fattori esterni (ad esempio livello di popolazione e interazioni a livello di ecosistema) giocano nella mediazione ecologicamente importante endpoint8. Di conseguenza, c’è una necessità per i metodi che includono un approccio più olistico senza sacrificare la fauna selvatica e/o vertebrati in laboratorio.

Sistemi di modello invertebrati marini, come Drosophila melanogaster, sono un’alternativa interessante per affrontare la necessità di un approccio più olistico per test di tossicità. D. melanogaster, è stato originariamente sviluppato come un sistema di modello invertebrati marini per la ricerca genetica umani circa un secolo fa11. D. melanogaster prominente è ora utilizzato come alternativa modello vertebrati per diversi motivi: 1) la conservazione di geni e percorsi tra d. melanogaster e gli esseri umani; 2) tempo di generazione breve rispetto ai modelli vertebrati; 3) economico costo di manutenzione; 4) alleviare nella generazione di campioni di grandi dimensioni; e 5) pletora di fenotipica ed ecologicamente-rilevanti endpoint disponibili per il test11,12,13,14,15,16,17 .

Diversi laboratori11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 ora stanno usando d. melanogaster come alternativa modello vertebrati per test di tossicità per comprendere gli effetti dell’inquinamento sugli esseri umani. Specie selvatiche locali di Drosophila può essere utilizzato, anche, come modelli di tossicità per la fauna selvatica (e gli esseri umani) rispondere a ecologicamente-, relativamente al comportamento-ed evolutivamente pertinenti domande a più livelli biologici di organizzazione. Utilizzando specie del genere Drosophila come modello, diversi endpoint misurabili sono possibili11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. Inoltre, utilizzando il modello di Drosophila , tossicologi possono: 1) eticamente collegare effetti a più livelli biologici dell’organizzazione; 2) incorporare il ruolo dei fattori emergenti e lo sviluppo; 3) studio endpoint ecologicamente importanti (oltre agli endpoint medicamente importanti); 4) verificare fattori di stress multipli contemporaneamente; 5) e prova a lungo termine multigenerazionale (ad es. evolutiva e transgenerazionale) implicazioni di fattori di stress. Pertanto, utilizzando la Drosophila come sistema modello consente una moltitudine di approcci, non limitato a studiare approcci meccanicistici con ceppi inbred di d. melanogaster nel laboratorio.

In questa carta, presentiamo i metodi di allevamento e raccolta della drosofila per rispondere a varie domande tossicologiche. Più specificamente, descriviamo la metodologia per 1) allevamento Drosophila in mezzo cucita con uno o più inquinanti; 2) raccogliendo Drosophila durante lo sviluppo (ad es. errante terza-instar larve, pupal casi, appena obtecta adulti e adulti maturi); e 3) l’allevamento della drosofila in medio contaminato e prova intergenerazionale e trasmissione transgenerazionale, come pure le implicazioni evolutive esposizione tossico a lungo termine. Utilizzando questo protocollo, il precedente autori18,19,20,21,22,23,24,25 sono segnalati diversi effetti fisiologici, genetici e comportamentali di sviluppo (Pb2 +) esposizione al piombo. Questo protocollo consente tossicologi di utilizzare un approccio più olistico e tossicologico, che è essenziale per comprendere come gli agenti inquinanti sono fattori di rischio per gli esseri umani e animali selvatici in un ambiente sempre più inquinato.

Protocol

Il seguente protocollo è un protocollo sperimentale utilizzato per posteriore specie del genere Drosophila su supporto contaminato quando l’ingestione orale di una tossina è appropriata; altre forme di esposizione sono possibili utilizzando la drosofila modello11,15,16,26. I metodi descritti nel presente protocollo precedentemente sono stati descritti da Hirsch et al.</e…

Representative Results

Di esporre oralmente Drosophila a un contaminant(s) durante lo sviluppo, possono essere testate varie domande tossicologiche esponendo Drosophila a diversi livelli di organizzazione biologica. Questa sezione presenta risultati rappresentativi ottenuti usando questo protocollo in articoli precedentemente pubblicati23,24. In particolare, questo protocollo è stato utilizzato in precedenza per valutare l’accumulo, e…

Discussion

Drosophila melanogaster è stato stabilito come un potente modello per una gamma di processi biologici a causa la conservazione ricca di geni e percorsi tra d. melanogaster e gli esseri umani13,14. Per le stesse ragioni che è un potente modello di scienza medica, Drosophila è emerso come un sistema di modello adatto per studiare l’impatto dell’inquinamento di origine antropica su una gamma di endpoint tossicologici. Diversi laboratori…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa pubblicazione è stata sostenuta da una sovvenzione del Department of Education (premio PR n #P031C160025-17, il titolo del progetto: 84,031 C) alle comunità Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) per costruire staminali attivo impegno (C-BASE). Ringraziamo corrente zoologia ed Elsevier per fornire i diritti per utilizzare i risultati rappresentativi pubblicati in precedenti lavori, come pure la redazione di Giove per averci fornito l’opportunità di pubblicare questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare il programma C-BASE, Dr. Brian Vanden Heuvel (C-BASE e dipartimento di biologia, CSU-Pueblo), dipartimento di biologia di CSU-Pueblo, Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (dipartimento di biologia, Skidmore College) e Dr. Claire Varian Ramos (Dipartimento di biologia, Pueblo Colorado State University) per il loro sostegno e assistenza.

Materials

Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24 Carolina Biological 173204
Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit Genessee Scientific 32-116SB Used to store flies
Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials Genessee Scientific 49-102 Used to store flies
Cardboard trays, trays only, narrow Genessee Scientific 32-124 Used to organize populations of flies
Cardboard trays, dividers only, narrow Genessee Scientific 32-126 Used to organize populations of flies
Thermo Scientific Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure Fischer Scientific 03-312D Useful for storage of contaminants
Thermo Scientific Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles Fischer Scientific 03-409-17C Useful for storage of contaminants
Eppendorf Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser Fischer Scientific 14-287-150 Used to prepare medium
Combitips Advanced Pipetter Tips – Standard, Eppendorf Quality Tips Fischer Scientific 13-683-708 Used to prepare medium
Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm) Genessee Scientific 59-114 Used to anesthetize flies
Flystuff foot valve Genessee Scientific 59-121 Used to anesthetize flies
Tubing, green (1 continguous foot/unit) Genessee Scientific 59-124G Used to anesthetize flies
Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle VWR 97064-130 Used to make a morgue
Glass Erlenmeyer Flask Set – 3 Sizes – 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2 Walmart Not applicable Used to make a morgue
BGSET5 Glass Beaker Set Of 5 Walmart
Inbred or wildtype line of Drosophila Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University https://bdsc.indiana.edu
Wild popultions of Drosophila UC San Diego Drosophila Stock Center https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php
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Riferimenti

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DrosophilaToxicity TestingInvertebrate ModelDose ResponseGrowth MediumDevelopmental StagesLarvaeAdultsExposureContaminants
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Citazione di questo articolo
Peterson, E. K., Long, H. E. Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory. J. Vis. Exp. (137), e57450, doi:10.3791/57450 (2018).
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