Protocolo experimental para el uso de Drosophila como sistema modelo de invertebrado para ensayos de toxicidad en el laboratorio
Summary
En este trabajo, proporcionamos un protocolo detallado para la exposición de especies en el género Drosophila a contaminantes con el objetivo de estudiar el impacto de la exposición en un rango de salidas fenotípicas en diferentes etapas de desarrollo y para más de una generación.
Abstract
Propiedades emergentes y factores externos (interacciones a nivel de población y ecosistema, en particular) desempeñan importantes funciones en la mediación de las terminales de importancia ecológica, aunque se consideran raramente en estudios toxicológicos. D. melanogaster se perfila como un modelo de toxicología para el impacto conductual, neurológico y genético de sustancias tóxicas, para nombrar unos pocos. Más importante aún, se pueden utilizar especies en el género Drosophila como sistema modelo para un enfoque marco integrador incorporar propiedades emergentes y responder preguntas ecológicamente relevantes en la investigación de Toxicología. El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo para la exposición de especies en el género Drosophila a contaminantes para ser utilizado como sistema modelo para una gama de salidas fenotípicas y ecológicamente pertinentes preguntas. Más específicamente, este protocolo permite 1) enlazar múltiples niveles biológicos de organización y entender el impacto de sustancias tóxicas en ambos fitness nivel de individuo y población; 2) prueba el impacto de sustancias tóxicas en las diferentes etapas de la exposición del desarrollo; 3) consecuencias multigeneracionales y evolutivo prueba de contaminantes; y 4) probar simultáneamente múltiples contaminantes y estresantes.
Introduction
Cada año, aproximadamente 1.000 nuevos productos químicos son introducidos por la industria química1,2; sin embargo, los impactos ambientales de sólo un pequeño porcentaje de estos productos químicos son probados antes de distribución2,3. Aunque catástrofes a gran escala son poco comunes, subletal y crónica de la exposición a una gran variedad de contaminantes están muy extendidos en los seres humanos y vida silvestre4,5. El enfoque histórico de toxicología ambiental y Ecotoxicología fue probar la mortalidad, sola exposición a sustancias químicas, la exposición aguda y los efectos fisiológicos de la exposición, como un medio de medir el impacto de los contaminantes sobre supervivencia6, 7 , 8 , 9 , 10. aunque hay un cambio hacia enfoques éticos y no invasivo para los ensayos con animales, enfoques actuales limitan debido al papel que desarrollo, propiedades emergentes y factores externos (como el nivel de población y interacciones a nivel de ecosistema) juegan en la mediación de extremos importancia ecológica8. Por lo tanto, hay una necesidad de métodos que incorporan un enfoque más holístico sin sacrificar la vida silvestre y vertebrados en el laboratorio.
Los sistemas modelo de invertebrado, como Drosophila melanogaster, son una atractiva alternativa para abordar la necesidad de un enfoque más holístico para ensayos de toxicidad. D. melanogaster, fue originalmente desarrollado como un sistema modelo de invertebrado para humanos relacionados con la investigación genética sobre hace un siglo11. D. melanogaster ahora prominente se utiliza como una alternativa de modelo vertebrados por varias razones: 1) la conservación de genes y rutas entre D. melanogaster y los seres humanos; 2) tiempo de generación corta en comparación con los modelos de vertebrados; 3) costo bajo costo de mantenimiento; 4) facilidad en la generación de tamaños de muestra grandes; y 5) gran cantidad de puntos finales fenotípica y ecológica-relevante disponibles para la prueba11,12,13,14,15,16,17 .
Varios laboratorios11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 ahora utilizan D. melanogaster como una alternativa de modelo vertebrados para ensayos de toxicidad para entender los impactos de la contaminación en los seres humanos. Especies silvestres de Drosophila pueden ser utilizadas, así como modelos de toxicidad para la fauna (y humanos) responder a ecológico-, su comportamiento-y evolutivamente relevantes cuestiones en múltiples niveles biológicos de organización. Utilizando especies dentro del género Drosophila como modelo, varios criterios de valoración cuantificables son posibles11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. In addition, utilizando el modelo de Drosophila , toxicólogos pueden: 1) enlace éticamente efectos en múltiples niveles biológicos de la organización; 2) incorporar el papel de los factores emergentes y desarrollo; 3) estudio de extremos ecológicamente importantes (además de extremos médicamente importantes); 4) prueba de estresores múltiples simultáneamente. 5) y prueba a largo plazo multigeneracional (e.g. evolutiva y transgeneracional) implicaciones de estresores. Por lo tanto, usando Drosophila como sistema modelo permite una multitud de enfoques, que no se limita a estudiar los enfoques mecanicistas con cepas endogámicas de D. melanogaster en el laboratorio.
En este trabajo, presentamos los métodos para la cría y recolección de Drosophila para responder diversas cuestiones toxicológicas. Más específicamente, se describe la metodología para 1) cría de Drosophila en medio con uno o más contaminantes; 2) recogida de Drosophila en desarrollo (p. ej. larvas de tercer estadio pupas casos, recién eclosed adultos y adultos maduros que vaga); y 3) cría de Drosophila en el medio contaminado a prueba intergeneracional y transgeneracional transmisión, así como implicaciones evolutivas de la exposición a largo plazo de sustancias tóxicas. Usando este protocolo, los anteriores autores18,19,20,21,22,23,24,25 han publicado diferentes efectos fisiológicos, genéticos y conductuales del desarrollo (Pb2 +) exposición al plomo. Este protocolo permite toxicólogos utilizar un enfoque más holístico de toxicológico, que es esencial para entender cómo los contaminantes son factores de riesgo para los seres humanos y vida silvestre en un ambiente cada vez cada vez más contaminado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster se ha establecido como un poderoso modelo para una variedad de procesos biológicos debido a la amplia conservación de genes y rutas de D. melanogaster y los seres humanos13,14. Por las mismas razones que es un potente modelo para la ciencia médica, la Drosophila ha surgido como modelo adecuado para estudiar el impacto de la contaminación antropogénica en una gama de puntos finales toxicológicos. Varios labo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta publicación fue apoyada por una beca del Departamento de Educación (Premio PR #P031C160025-17, título del proyecto: 84,031 C) a las comunidades de Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) al compromiso de construir activos tallo (BASE C). Agradecemos a Zoología actual y Elsevier para proporcionar los derechos para utilizar los resultados representativos publicados en trabajos previos, así como los editores de Zeus por habernos brindado la oportunidad de publicar este protocolo. También nos gustaría agradecer al programa de BASE de C, Dr. Brian Vanden Heuvel (C-BASE y Departamento de biología, CSU-Pueblo), Departamento de Biología de CSU-Pueblo, Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (Departamento de biología, Universidad de Skidmore) y la doctora Claire Varian Ramos (Departamento de biología, Colorado State University-Pueblo) por su apoyo y ayuda.
Materials
| Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24 | Carolina Biological | 173204 | |
| Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit | Genessee Scientific | 32-116SB | Used to store flies |
| Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials | Genessee Scientific | 49-102 | Used to store flies |
| Cardboard trays, trays only, narrow | Genessee Scientific | 32-124 | Used to organize populations of flies |
| Cardboard trays, dividers only, narrow | Genessee Scientific | 32-126 | Used to organize populations of flies |
| Thermo Scientific Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure | Fischer Scientific | 03-312D | Useful for storage of contaminants |
| Thermo Scientific Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles | Fischer Scientific | 03-409-17C | Useful for storage of contaminants |
| Eppendorf Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser | Fischer Scientific | 14-287-150 | Used to prepare medium |
| Combitips Advanced Pipetter Tips – Standard, Eppendorf Quality Tips | Fischer Scientific | 13-683-708 | Used to prepare medium |
| Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm) | Genessee Scientific | 59-114 | Used to anesthetize flies |
| Flystuff foot valve | Genessee Scientific | 59-121 | Used to anesthetize flies |
| Tubing, green (1 continguous foot/unit) | Genessee Scientific | 59-124G | Used to anesthetize flies |
| Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle | VWR | 97064-130 | Used to make a morgue |
| Glass Erlenmeyer Flask Set – 3 Sizes – 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2 | Walmart | Not applicable | Used to make a morgue |
| BGSET5 Glass Beaker Set Of 5 | Walmart | ||
| Inbred or wildtype line of Drosophila | Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University | https://bdsc.indiana.edu | |
| Wild popultions of Drosophila | UC San Diego Drosophila Stock Center | https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php |
Riferimenti
- Postel, S. . Defusing the Toxics Threat: Controlling Pesticides and Industrial Waste. , (1987).
- Vitousek, P. M., Mooney, H. A., Lubchenco, J., Melillo, J. M. Human domination of earth’s ecosystems. Science. 277, 494-499 (1997).
- United Nations Environment Program (UNEP). . Saving Our Planet: Challenges and Hopes. , (1992).
- Hansen, L. J., Johnson, M. L. Conservation and toxicology: Integrating the disciplines. Conservation Biology. 13, 1225-1227 (1999).
- Johnston, E. L., Mayer-Pinto, M., Crowe, T. P. REVIEW: Chemical contaminant effects on marine ecosystem functioning. Journal of Applied Ecology. 52, 140-149 (2015).
- Dell’Omo, G. . Behavioral ecotoxicology. , (2002).
- Clotfelter, E. D., Bell, A. M., Levering, K. R. The role of animal behaviour in the study of endocrine-disrupting chemicals. Animal Behaviour. 68, 665-676 (2004).
- Peterson, E. K., Buchwalter, D. B., Kerby, J. L., LeFauve, M. K., Varian-Ramos, C. W., Swaddle, J. P. Integrative behavioral ecotoxicology: bringing together fields to establish new insight to behavioral ecology, toxicology, and conservation. Current Zoology. 63, 185-194 (2017).
- Scott, G. R., Sloman, K. A. The effects of environmental pollutants on complex fish behaviour: Integrating behavioural and physiological indicators of toxicity. Aquatic Toxicology. 68, 369-392 (2004).
- Zala, S. M., Penn, D. J. Abnormal behaviors induced by chemical pollution: A review of the evidence and new challenges. Animal Behaviour. 68, 649-664 (2004).
- Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic & Applied Medicine. 1, 33-38 (2013).
- Jennings, B. H. Drosophila-a versatile model in biology and medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacology Reviews. 63, 411-436 (2011).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287, 2204-2215 (2000).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 32, 74 (2010).
- Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1.12.1-1.12.20 (2015).
- Burke, M. K., Rose, M. R. Experimental evolution with Drosophila. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 296, R1847-R1854 (2009).
- He, T., Hirsch, H. V. B., Ruden, D. M., Lnenicka, G. A. Chronic lead exposure alters presynaptic calcium regulation and synaptic facilitation in Drosophila larvae. NeuroToxicology. 30, 777-784 (2009).
- Hirsch, H. V., et al. Behavioral effects of chronic exposure to low levels of lead in Drosophila melanogaster. NeuroToxicology. 24, 435-442 (2003).
- Hirsch, H. V. B., et al. Variations at a quantitative trait locus (QTL) affect development of behavior in lead-exposed Drosophila melanogaster. NeuroToxicology. 30, 305-311 (2009).
- Morley, E. J., Hirsch, H. V. B., Hollocher, K., Lnenicka, G. A. Effects of chronic lead exposure on the neuromuscular junction in Drosophila larvae. NeuroToxicology. 24, 35-41 (2003).
- Ruden, D. M., et al. Genetical toxicologenomics in Drosophila identifies master- modulatory loci that are regulated by developmental exposure to lead. NeuroToxicology. 30, 898-914 (2009).
- Peterson, E. K., et al. Accumulation, elimination, sequestration, and genetic variation of lead (Pb2+) loads within and between generations of Drosophila melanogaster. Chemosphere. 181, 368-375 (2017).
- Peterson, E. K., et al. Asymmetrical positive assortative mating induced by developmental lead (Pb2+) exposure in a model system, Drosophila melanogaster. Current Zoology. 63, 195-203 (2017).
- Peterson, E. K. . Consequences of developmental lead (Pb2+) exposure on reproductive strategies in Drosophila. , (2016).
- Chifiriuc, M. C., Ratiu, A. C., Popa, M., Ecovolu, A. A. Drosophotoxicology: An emerging research area for assessing nanoparticles interaction with living organisms. International Journal of Molecular Sciences. 17, 36 (2016).
- Lachaise, D., Cariou, M. L., David, J. R., Lemeunier, F., Tsacas, L., Ashburner, M. Historical biogeography of the Drosophila melanogaster species subgroup. Evolutionary Biology. 22, 159-225 (1988).
- Elgin, C. R., Miller, D. W., Ashburner, M., Wright, T. R. F. Mass rearing of flies and mass production and harvesting of embryos. The Genetics and Biology of Drosophila. 2a, 112-121 (1978).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, C. R. Chapter 5: Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods in Cell Biology. 44, 99-108 (1994).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Jennings, J. H., Etges, W. J., Schmitt, T., Hoikkala, A. Cuticular hydrocarbons of Drosophila montana: geographic variation, sexual dimorphism and potential roles as pheromones. Journal of Insect Physiology. 61, 16-24 (2014).
- Markow, T. A., O’Grady, P. M. . Drosophila: A Guide to Species Identification and Use. , (2005).
- Werner, T., Jaenike, J. . Drosopholids of the midwest and northeast. , (2017).
- Greenspan, R. J. The basics of doing a cross. Fly Pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , 3-24 (1997).
- JoVE Science Education Database. . . Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. , (2018).
- Castañeda, P. L., Muñoz, G. L. E., Durán, D. A., Heres, P. M. E., Dueñas, G. I. E. LD50 in Drosophila melanogaster. fed on lead nitrate and lead acetate. Drosophila Information Service. 84, 44-48 (2001).
- Massie, H. R., Aiello, V. R., Whitney, S. J. P. Lead accumulation during aging of Drosophila and effect of dietary lead on life span. Age. 15, 47-49 (1992).
- Akins, J. M., Schroeder, J. A., Brower, D. L., Aposhian, H. V. Evaluation of Drosophila melanogaster as an alternative animal for studying the neurotoxicity of heavy metals. BioMetals. 5, 111-120 (1992).
- Zhou, S., et al. The genetic basis for variation in sensitivity to lead toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Health Perspectives. 124, 1062-1070 (2016).
- Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Delayed male maturity is a cost of producing large sperm in Drosophila. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 92, 10614-10618 (1995).
- Beauchemin, D. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82, 4786-4810 (2010).
- Tyler, M. S., Tyler, M. S. Development of the fruit fly Drosophila melanogaster. Developmental Biology, a Guide for Experimental Study. , 8-27 (2000).
- Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107, 416-426 (2009).
- Bonilla, E., Contreras, R., Medina-Leendertz, S., Mora, M., Villalobos, V., Bravo, Y. Minocycline increases the life span and motor activity and decreases lipid peroxidation in manganese treated Drosophila melanogaster. Toxicology. 294, 50-53 (2012).
- Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 199-228 (2003).
- Posgai, R., Cipolla-McCulloch, C. B., Murphy, K. R., Hussain, S. M., Rowe, J. J., Nielsen, M. G. Differential toxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles on Drosophila melanogaster development, reproductive effort, and viability: size, coatings and antioxidants matter. Chemosphere. 85, 34-42 (2011).
- Gupta, S. C., et al. Adverse effect of organophosphate compounds, dichlorvos and chlorpyrifos in the reproductive tissues of transgenic Drosophila melanogaster: 70kDa heat shock protein as a marker of cellular damage. Toxicology. 238, 1-14 (2007).
- Wasserkort, R., Koller, T. Screening toxic effects of volatile organic compounds using Drosophila melanogaster. Journal of Applied Toxicology. 17, 119-125 (1997).
- Markow, T. A., O’Grady, P. O. Reproductive ecology of Drosophila. Functional Ecology. 22, 747-759 (2008).
- Dev, K., Chahal, J., Parkash, R. Seasonal variations in the mating-related traits of Drosophila melanogaster. Journal of Ethology. 31, 165-174 (2013).
- Salminen, T. S., Vesala, L., Laiho, A., Merisalo, M., Hoikkala, A., Kankare, M. Seasonal gene expression kinetics between diapause phases in Drosophila virilus group species and overwintering differences between diapausing and non-diapausing females. Nature Scientific Reports. 5, 11197 (2015).
- Miller, R. S., Thomas, J. L. The effects of larval crowding and body size on the longevity of adult Drosophila melanogaster. Ecology. 39, 118-125 (1958).
- Peterson, E. K., Ghiradella, H., Possidente, B., Hirsch, H. Transgenerational epigenetic effects of lead exposure on behavior in Drosophila melanogaster. 11, 492-493 (2012).
- Soares, J. J., et al. Continuous liquid feeding: New method to study pesticides toxicity in Drosophila melanogaster. Analytical Biochemistry. 537, 60-62 (2017).
