Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Randi M. Mackler; Miguel A. Lopez Jr.; Kristine E. Yoder

doi:10.3791/57453

JoVE Journal > Immunology and Infection

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Immunologia e infezioni

Montage und Reinigung der Prototyp schaumig Virus Intasomes

Published: March 19, 2018

doi:

10.3791/57453

Randi M. Mackler, Miguel A. Lopez Jr., Kristine E. Yoder

¹Department of Cancer Biology and Genetics,The Ohio State University College of Medicine

Summary

Rekombinante Retroviren Integrase und DNA-Oligomere imitiert virale DNA enden können einen enzymatisch aktiven Komplex bekannt als ein Intasome bilden. Intasomes können für biochemische, strukturellen und kinetischen Studien verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie zu montieren und zu reinigen Prototyp schaumig Virus Intasomes.

Abstract

A Definition von Funktion und notwendiger Schritt des Lebenszyklus Retrovirus ist die Integration des viralen Genoms in das Wirtsgenom. Alle Retroviren kodiert eine Integrase (IN)-Enzym, das katalysiert die kovalente Verbindung von viralen Host DNA, bekannt als Strang übertragen. Integration kann modelliert in Vitro mit rekombinante Retroviren und DNA-Oligomere imitiert die Enden des Virusgenoms. Um genauer rekapitulieren die Integration-Reaktion, die auftritt, in Vivo, Integration sind komplexe von rekombinanten IN und synthetischen Oligomere durch Dialyse in einem reduzierten Salzgehalt Puffer montiert. Die Integration komplexer, genannt eine Intasome kann durch Größe Ausgrenzung Chromatographie gereinigt werden. Bei Prototyp schaumig Virus (PFV) der Intasome ist ein Tetramer von innen und zwei DNA-Oligomere und ist leicht von Monomeren IN und kostenlose Oligomer DNA getrennt. Die Effizienz der Integration des PFV Intasomes kann unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen für die Dynamik besser zu verstehen und Mechanik der retroviralen Integration untersucht.

Introduction

Integration des viralen Genoms in das Wirtsgenom ist ein obligatorischer Schritt im Lebenszyklus von allen Retroviren¹. Das virale Enzym Integrase (IN) katalysiert die kovalente Verbindung der beiden Enden der viralen DNA-Genom an den Host DNA. Während einer zellulären Infektion gehört eine Vorintegration Komplex, die die Integration vermittelt. Rekombinante IN komplexiert mit doppelten gestrandeten DNA-Oligomere imitiert die virale DNA-enden können auch die Integration in ein Ziel DNA in Vitro²durchführen. Eine gemeinsame Integration Assay in Vitro nutzt ein supercoiled Plasmid als Ziel DNA. Integration der beiden virale DNA-Oligomere (vDNA) auf dem Plasmid führt zu einem linearen Produkt und ist abgestimmte Integration (Abbildung 2A) bezeichnet. Die Integration Tests in Vitro können auch Produkte mit nur ein vDNA kovalent an das Ziel-Plasmid, was zu einem entspannten Kreis trat führen. Dieser halb-Website Integration Produkt scheint ein Artefakt der Assay in Vitro.

IN rekombinanten und vDNA Integration in Vitroverrichten, aber sie sind nicht ideal Reagenzien für das Studium der Dynamik oder die Struktur der komplexe Integration, wenn Monomere IN relevanten Visualisierung verdecken würde. Gereinigte Integration komplexe oder “Intasomes” sind für dynamische Einzelmolekül-Analyse oder strukturelle Studien erforderlich. PFV IN und vDNAs können durch Dialyse aus einem relativ hohen Salzkonzentration Puffer zu einem niedrigeren Salzkonzentration³^,⁴montiert werden. Während der Dialyse, einen Niederschlag Formen. Dieser Niederschlag aus Dialyse entfernt und die Salzkonzentration steigt. Die höheren Salzkonzentration solubilisiert überstürzten enthaltenden PFV-Intasomes. Die Intasomes werden dann durch Größe Ausgrenzung Chromatography (SEC) gereinigt. Rekombinante Prototyp schaumig Virus (PFV) IN nachweislich als ein Monomer in Lösung in Konzentrationen bis zu 225 µM⁵existieren. SEC Fraktionierung trennt effektiv PFV Intasomes (225.5 kDa), die ein Tetramer des PFV IN und zwei vDNAs umfasst, von Monomeren PFV IN (44,4 kDa) und freie vDNA (24,0 kDa). Der PFV Intasomes können eingefroren werden und Integration Aktivität für mindestens sechs Monate Lagerung bei-80 ° c aufbewahren.

Rekombinante PFV Intasomes kann auch geändert werden, um IN Aminosäure Substitutionen oder abschneiden Mutationen oder vDNAs beschriftet mit Fluorophore oder Biotin⁴^,⁶erweitert. Die gereinigten PFV Intasomes durchführen ohne weiteres Integration in ein Ziel supercoiled Plasmid DNA in Vitro. Bulk-biochemische Integration-Assays mit Intasomes können die Auswirkungen der IN Mutationen im Hemmer oder sonstigen chemischen Zusätzen testen. Biotinylierte Intasomes kann verwendet werden, Affinität mit Nukleinsäuren oder Proteine zu untersuchen. PFV Intasomes funktionieren bei Umgebungstemperatur zulassend Einzelmolekül-Mikroskopie-Analyse von magnetischen Pinzette Messung die Zeit zwischen den Beitritt der beiden vDNA enden oder Totalreflexion Fluoreszenz, die Intasome Suche auf Ziel zu visualisieren DNA-⁶. Darüber hinaus wurden PFV Intasomes die erste strukturell sein deutlich beeinflussen das Feld von Retroviren Integration³gekennzeichnet.

Protocol

(1) Glühen des vDNA Mähdrescher 1 X 10-Puffer (10 X 10 Lager: 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl 10 mM EDTA), 10 µM Oligo-1 (5′ ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3′, 100 µM-Lager) und 10 µM Oligo-2 (5′ CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3′, 100 µM-Lager) in einem Endvolumen von 1,5 mL . Aliquoten 25 µL in sechzig 0,2 mL Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Röhren.Hinweis: Abhängig von der Anwendung können Oligomere mit Fluorophore oder Tags am 5′-Ende von Oligo 2 oder als eine interne amino-T…

Representative Results

PFV Intasomes werden von rekombinanten IN und vDNA montiert. Nach der Montage sind Intasomes durch SEC (Abbildung 1) gereinigt. Integration-Aktivität der einzelnen Fraktionen ist mit einem supercoiled DNA Ziel- und Agarose Gelelektrophorese (Abbildung 2) untersucht. Dieses Gel wird mit einem fluoreszierenden Scanner eingestellt, erkennt EtBr (und Fluorophor, wenn Fluorophore beschriftet vDNA verwendet wird) abgebildet. Bildanaly…

Discussion

Retroviren INs bilden einen Komplex mit viralen genomischen DNA führen Integration und weiter den viralen Lebenszyklus Multimeric. Die Anzahl der im Monomeren pro Intasome möglicherweise Tetramers, Octamers oder eventuell höhere Ordnung Multimere¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴. PFV Intasomes sind, dass ein Tetramer des rekombinanten mit doppelsträngigen DNA-Oligomere, die viralen genomischen DNA zu imitieren e…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von NIH AI099854 und AI126742 auf Schlüssel unterstützt.

Materials

DNA Oligomers	IDT	N/A	Custom DNA Oligos
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters	Sigma-Aldrich	Z677094-24EA	3 kDa MWCO
DTT	P212121	SV-DTT
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
ZnCl₂	Sigma-Aldrich	208086
MgSO₄	Amresco	0662
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G37-20
Gel-loading tips, 1 – 200 μL	Corning	CLS4853-400EA
Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100	Fisher Scientific	12-640
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL	Thermo Fisher Scientific	568-0020
Dialysis tubing clips	Spectrum Labs	132734
6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201
Hi-Res Standard Agarose	AGTC Bioproducts	AG500D1
Ethidium bromide	Thermo Fisher Scientific	BP1302
Orange G	Fisher Scientific	0-267
Hyladder 10kb, 500 lanes	Denville Scientific	CB4225-4

Riferimenti

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Citazione di questo articolo

Mackler, R. M., Lopez Jr., M. A., Yoder, K. E. Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes. J. Vis. Exp. (133), e57453, doi:10.3791/57453 (2018).