Bestemmelse af Protease specificitet i mus væv ekstrakter af MALDI-TOF-massespektrometri: manipulere PH for at forårsage specificitet ændringer
Summary
Vi præsenterer her, en protokol til at bestemme protease specificitet i rå mus væv ekstrakter bruger MALDI-TOF-massespektrometri.
Abstract
Proteaser har flere biologiske funktioner, herunder protein Aktivering/inaktivering og fødevarer fordøjelse. At identificere protease specificitet er vigtigt for at afsløre protease funktion. Den metode, der foreslås i denne undersøgelse bestemmer protease specificitet ved at måle molekylvægt af unikke substrater ved hjælp af Matrix assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight (MALDI-TOF) massespektrometri. Substraterne indeholder iminobiotin, mens webstedet kløvet består af aminosyrer, og spacer består af polyethylen glycol. Kløvet underlaget vil generere en unik Molekylær vægt ved hjælp af en kløvet aminosyre. En af fordelene ved denne metode er at det kan gennemføres i en gryde ved hjælp af rå prøver, og det er også velegnet til vurdering af flere prøver. I denne artikel vil beskrive vi en simpel eksperimentelle metode optimeret med prøver udvundet fra mus lungevæv, herunder væv udvinding, placering af fordøjelsessystemet substrater til prøver, oprensning fordøjelsessygdomme underlag under forskellige pH betingelser , og måling af substrater Molekylær vægt ved hjælp af MALDI-TOF-massespektrometri. I Resumé, denne teknik giver mulighed for identifikation af protease specificitet i rå prøver stammer fra væv ekstrakter bruger MALDI-TOF-massespektrometri, som kan let skaleres til flere prøve behandling.
Introduction
Proteaser regulere fysiologiske processer ved holde proteiner, og indledningen af protease aktivitet på bestemte tidspunkter og steder er reguleret1. Det er derfor vigtigt at identificere udtryk og aktivitet af væv, der reguleres lokalt og udvikle en ny metode til at registrere proteaser. Metoden, der foreslås i denne undersøgelse har til formål at identificere protease specificitet i parallel til at afsløre proteaser.
Der er nogle metoder til påvisning af protease specificitet. Metoden azocasein er kendt for sin brug i påvisning af proteaser2 men er begrænset i sin evne til at indhente yderligere oplysninger. Zymography er en anden omfattende protease påvisningsmetode, der kan bruges til at bestemme molekylvægt af proteaser3, men det kan ikke bruges til at undersøge substrat specificitet. Protease specificitet kan bestemmes af spektrometrisk assays, ved hjælp af substrater såsom p-nitroanilide4, og fluorometriske assays, ved hjælp af cumarin substrater5 eller fluorescens resonans energi overføre (FRET) assays6. Disse metoder aktiverer single-specificitet påvisning af substrater indeholdt i en enkelt brønd. I den foreliggende undersøgelse undersøges protease specificiteten af væv ekstrakter under forskellige betingelser, som disse ekstrakter indeholder flere proteaser. Protease aktivitet er reguleret af flere faktorer, herunder pH, coenzymer, prostetiske grupper og ion styrke. For nylig, proteomics-baserede metoder har været anvendt til at identificere protease specificitet; for eksempel, den metode, der er rapporteret af Biniossek mfl. 7 bruger proteomet til at bestemme substrat specificitet selv i rå ekstrakter og giver mulighed for præcis bestemmelse af kavalergang aktivitet af proteaser, der genkender flere aminosyre-sekvenser8. Men denne metode er ikke egnet for analysen af mange prøver. I modsætning hertil vores metode giver samtidig behandling af flere prøver, og brug af Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight (MALDI-TOF) massespektrometri for analysen muliggør hurtig og nem opdagelse af den kløvet substrater.
Dette papir beskriver en metode til at vurdere protease specificitet ved hjælp af MALDI-TOF-massespektrometri til at måle molekylvægt af unikke substrater. De molekylære former for kløvet substrater, sammen med deres teoretiske Molekylær vægte, er vist i figur 1 og tabel 1. Tidligere undersøgelser har brugt substrater indeholdende polyglycine spacere og biotin9; men disse substrater er mangelfuldt, fordi polyglycine sekvens kan kløves af enzymer, der anerkender glycin sekvensen. Derudover kan høj affinitet mellem begærlighed og biotin føre til en lav inddrivelsessats. At forbedre disse ulemper, i denne undersøgelse vi syntetiseret et unikt underlag, som var sammensat af polyethylenglycol (PEG), iminobiotin og en aminosyre, der kunne identificere kavalergang websted (figur 1). For at skelne mellem aminosyrer af lignende Molekylær vægte, blev D-Serin tilføjet mellem PIND spacer og aminosyre på webstedet kløvet.
N-terminalen af substratet var mærket med iminobiotin, som muliggør affinitet rensning fra rå prøver. Brug af iminobiotin i stedet for biotin er kritisk. Biotin har en stærk affinitet med begærlighed, hvilket resulterer i lav genfindingsprocent biotin-mærket underlag fra begærlighed harpiks, mens iminobiotin’s affinitet for begærlighed kan ændres af pH. Iminobiotin-mærket substrater vil binde sig til begærlighed i betingelserne ovenfor pH 9, mens begærlighed frigiver iminobiotin-mærket substrater i betingelser under pH 4. Derfor blev iminobiotin brugt til affinitet rensning10. I Resumé beskriver vi en detaljeret protokol til påvisning af protease specificitet ved hjælp af unikke substrater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol bruger MALDI-TOF-massespektrometri til at identificere protease specificitet i rå prøver stammer fra væv ekstrakter og kan let skaleres til flere prøve behandling. Især manipuleret vi pH for at forårsage en ændring i substrat specificitet.
Avidin-biotin komplekse (ABC) metode, som har været meget anvendt i biokemi på grund af dets bindende specificitet, blev udnyttet i vores protokol. På grund af det stærke affinitet af ABC er binding af begærlighed at biotin næsten…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist understøttet af Nihon farmaceutiske Universitet forskning tilskud fra Nihon farmaceutiske Universitet (2016) og MEXT KAKENHI Grant nummer JP17854179.
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
Riferimenti
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
