MALDI 质谱法测定小鼠组织提取物蛋白酶特异性: 操作 PH 值导致特异性改变
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以确定蛋白酶特异性的粗鼠组织提取物使用 MALDI 的光谱。
Abstract
蛋白酶具有多种生物学功能, 包括蛋白质活化/失活和食物消化。鉴定蛋白酶特异性对揭示蛋白酶功能具有重要意义。本研究提出的方法通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间 (MALDI) 质谱法测定独特基质的分子量来确定蛋白酶的特异性。基体中含有 iminobiotin, 而劈裂部位由氨基酸组成, 间隔由聚乙二醇组成。被劈裂的基底将产生一个独特的分子量, 使用裂解氨基酸。该方法的优点之一是可以用粗样品在一锅中进行, 也适用于多种样品的评估。在本文中, 我们描述了一个简单的实验方法优化, 从小鼠肺组织提取的样本, 包括组织抽取, 消化基质的放置到样品, 消化基质的纯化在不同的 pH 条件下, 用 MALDI 质谱法测定基质的分子量。总之, 这项技术可以识别的蛋白酶特异性从组织提取物中获得的 MALDI 的质谱, 可以很容易地扩大到多样本处理。
Introduction
蛋白酶通过裂解蛋白质调节生理过程, 并且在特定时间和地点启动蛋白酶活性的调控1。因此, 确定局部调节组织的表达和活性是很重要的, 并开发一种新的检测蛋白酶的方法。本研究提出的方法旨在鉴别蛋白酶的特异性, 同时检测蛋白酶。
有几种检测蛋白酶特异性的方法。azocasein 方法在检测蛋白酶2中是众所周知的, 但在获取进一步信息的能力方面是有限的。酶谱法是另一种综合的蛋白酶检测方法, 可用于测定蛋白酶的分子量3, 但它不能用于检查基底特异性。蛋白酶特异性可以通过光谱分析, 使用 nitroanilide4的基质, 和荧光化验, 使用香豆素基底5或荧光共振能量转移 (烦恼) 化验6。这些方法使单个井中所含基底的单特异性检测得以实现。本研究在不同条件下考察组织提取物的蛋白酶特异性, 因为这些萃取物含有多种蛋白酶。蛋白酶活性受多种因素的制约, 包括 pH 值、辅、假体组和离子强度。近年来, 蛋白质组学方法已被用于鉴定蛋白酶特异性;例如, 由 Biniossek et al报告的方法。7使用蛋白质组来确定基材的特异性, 即使是在粗提取物中, 也可以精确地测定识别多个氨基酸序列8的蛋白酶的裂解活性。但是, 这种方法不适合对大量样品进行分析。相比之下, 我们的方法可以同时处理多个样本, 利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间 (MALDI) 质谱进行样品分析, 便于快速、简便地检测出基质。
本文概述了用 MALDI 质谱法测定蛋白酶特异性的方法, 以测量独特基质的分子量。在图 1和表 1中显示了被切割基底的分子形式以及它们的理论分子权重。以前的研究使用了含有 polyglycine 间隔和生物素9的基质;然而, 这些基质是有缺陷的, 因为 polyglycine 序列可能会由识别甘氨酸序列的酶所切割。此外, 亲和和生物素之间的高度亲和性可能导致回收率低。为了改善这些缺点, 我们在本研究中合成了一种独特的基质, 它由聚乙二醇 (PEG)、iminobiotin 和氨基酸组成, 它可以识别出裂解部位 (图 1)。为了区分相似分子量的氨基酸, 在 PEG 间隔与氨基酸在劈裂部位添加 d-丝氨酸。
该基板的 N 端被标记为 iminobiotin, 这使得从粗样品中进行亲和纯化。使用 iminobiotin 而不是生物素是至关重要的;生物素与亲和有很强的亲和性, 这导致亲和树脂的生物素标记基质的回收率较低, 而 iminobiotin 对亲和的亲和性可以通过 pH 值来改变。在 ph 值为9的条件下, Iminobiotin 标记的基板将绑定到亲和, 而亲和在 4 ph 值以下的条件下释放 Iminobiotin 标记的基底。因此, iminobiotin 用于亲和纯化10。总之, 我们描述了一个详细的协议, 以检测蛋白酶特异性使用独特的基质。
Protocol
Representative Results
Discussion
本协议采用 MALDI 质谱法对组织提取物中的粗样品中的蛋白酶特异性进行识别, 并可方便地进行多样本加工。特别是, 我们操纵 pH 值导致基材特异性的改变。
亲和生物素复合物 (ABC) 方法在生物化学中得到了广泛应用, 其结合特异性, 在我们的协议中得到了应用。由于 ABC 的强烈亲和力, 亲和对生物素的约束几乎是不可逆转的。因此, 对 abc 的亲和纯化效率极低。因此, 我们报告说, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作部分是由日本制药大学的日本制药大学研究补助金 (2016) 和下个 KAKENHI 赠款号 JP17854179 资助的。
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
Riferimenti
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