Bestämning av proteashämmare specificitet i mus vävnad extrakt av MALDI-TOF-masspektrometri: manipulera PH för att orsaka specificitet förändringar
Summary
Här presenterar vi ett protokoll att bestämma proteas specificitet i rå mus vävnad extrakt med MALDI-TOF-spektrometri.
Abstract
Proteaser har flera biologiska funktioner, inklusive protein aktivering och inaktivering och mat matsmältning. Identifiera proteas specificitet är viktigt för att avslöja proteas funktion. Den metod som föreslås i denna studie bestämmer proteas specificitet genom att mäta molekylvikten för unika substrat med Matrix-assisted Laser Desorption/jonisering Time-of-Flight (MALDI-TOF) masspektrometri. Substratesna innehåller iminobiotin, medan klyvs webbplatsen består av aminosyror och distansringen består av polyetylenglykol. Klyvs underlaget kommer att generera en unik molekylvikt med hjälp av en aminosyra som klyvs. En av fördelarna med denna metod är att det kan utföras i en kruka med rå prover, och den är också lämplig för att bedöma flera prover. I den här artikeln beskriver vi en enkel experimentell metod optimerad med prover ur musen lungvävnad, inklusive vävnad utvinning, placering av mag substrat i prover, rening av mag substrat under olika pH förhållanden , och mätning av de substrat molekylvikt med hjälp av MALDI-TOF-masspektrometri. Sammanfattningsvis kan denna teknik för identifiering av proteashämmare specificitet i rå prover från vävnad extrakt med MALDI-TOF masspektrometri, som enkelt kan skalas för flera prov bearbetning.
Introduction
Proteaser reglera fysiologiska processer genom att klyva proteiner och inledandet av proteas aktivitet på bestämda tider och platser är reglerade1. Det är därför viktigt att identifiera uttryck och aktivitet av vävnader som regleras lokalt, och att utveckla en ny metod för att upptäcka proteaser. Metoden som föreslås i denna studie syftar till att identifiera proteas specificitet parallellt till att upptäcka proteaser.
Det finns några metoder för att upptäcka proteas specificitet. Azocasein metoden är välkänt för dess användning för detektion av proteaser2 men är begränsad i sin förmåga att få ytterligare information. Zymography är en annan omfattande proteas detektionsmetod som kan användas för att bestämma molekylvikten för proteaser3, men det kan inte användas för att undersöka substrat specificitet. Proteas specificitet kan bestämmas av spektrometriska analyser, använder substrat såsom p-nitroanilide4, och fluorometric analyser, använder kumarin substrat5 eller fluorescens resonans energi överföring (bandet) analyser6. Dessa metoder aktivera single-specificitet detektering av substrat som ingår i en enda brunn. I den aktuella studien undersöks proteas specificitet vävnad extrakt under olika villkor, eftersom dessa utdrag innehåller flera proteaser. Proteas aktivitet styrs av flera faktorer, inklusive pH, coenzymer, prosthetic grupper och ion styrka. Nyligen, proteomik-baserade metoder har använts för att identifiera proteas specificitet; till exempel, den metod som rapporterats av Biniossek et al. 7 använder proteomet för att avgöra substrat specificitet även i rå extrakt och tillåter noggrann bestämning av aktiviteten klyvning av proteaser som känner igen flera amino syra ordnar8. Men är denna metod inte lämplig för analys av många prover. Däremot vår metod möjliggör samtidig bearbetning av flera prover, och användningen av laser Laser Desorption/jonisering Time-of-Flight (MALDI-TOF) masspektrometri för provanalys underlättar snabb och enkel detektion av den klyvs substrat.
Detta dokument beskriver en metod för att utvärdera proteas specificitet med hjälp av MALDI-TOF masspektrometri för att mäta molekylvikten för unika substrat. De molekylära formerna av klyvs substrat, tillsammans med deras teoretiska molekylvikt, visas i figur 1 och tabell 1. Tidigare studier har använt substrat som innehåller polyglycine distanser och biotin9. dessa substrat är dock bristfällig eftersom den polyglycine sekvensen kan vara klyvs av enzymer som känner igen sekvensen glycin. Dessutom kan hög affinitet mellan avidinen och biotin leda till en låg återvinningsgrad. Att förbättra dessa nackdelar, i denna studie vi syntetiseras en unik substrat, som bestod av polyetylenglykol (PEG), iminobiotin och en aminosyra som kunde identifiera webbplatsen klyvning (figur 1). För att diskriminera mellan aminosyror av liknande molekylvikter, lades D-serine mellan PEG mellanlägget och den amino syran på webbplatsen klyvs.
N-terminalen av substratet var märkt med iminobiotin, som möjliggör affinitet rening från rå prover. Användning av iminobiotin i stället för biotin är kritisk; Biotin har en stark samhörighet med avidinen, vilket resulterar i låg återvinningsgrad av biotin-märkt substrat från avidinen harts, medan iminobiotin’s affinitet för avidinen kan ändras av pH. Iminobiotin-märkt substrat binder till avidinen i villkoren ovan pH 9, medan metoden släpper iminobiotin-märkt substrat i villkoren nedan pH 4. Därför användes iminobiotin för affinitet rening10. Sammanfattningsvis beskriver vi ett detaljerat protokoll för att upptäcka proteas specificitet med hjälp av unika substrat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll används MALDI-TOF masspektrometri för att identifiera proteas specificitet i rå prover från vävnad extrakt och kan enkelt skalas för flera prov bearbetning. I synnerhet manipuleras vi pH för att orsaka en förändring i substrat specificitet.
Avidinen-biotin komplexa (ABC) metoden som har använts i biokemi på grund av dess bindande särart, utnyttjades i våra protokoll. På grund av den starka samhörighet av ABC är bindningen av metoden att biotin nästan oåterkall…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds delvis av den Nihon farmaceutiska universitet forskningsanslag från Nihon läkemedels universitet (2016) och den MEXT KAKENHI Grant nummer JP17854179.
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
Riferimenti
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
