Retrospektiv MicroRNA sekvensering: Komplementære DNA biblioteket forberedelse protokollen bruker Formalin-fast parafin-embedded RNA prøver
Summary
Formalin-fast parafin-embedded prøver representerer en verdifull kilde til molekylær biomarkers menneskelige sykdommer. Her presenterer vi en laboratorie-baserte cDNA biblioteket forberedelse protokoll, opprinnelig designet med fersk frosne RNA og optimalisert for analyse av arkiverte microRNAs fra vev lagret opp til 35 år.
Abstract
-Arkiverte, klinisk klassifisert formalin-fast kan parafin-embedded (FFPE) vev gi nukleinsyrer for retrospektiv molekylære studier av hudkreft. Ved å bruke ikke-invasiv eller pre-ondartet lesjoner fra pasienter som senere utvikler invasiv sykdom, kan gene expression analyser bidra til å identifisere tidlig molekylær endringer som disponerer til kreftrisiko. Det har vært godt beskrevet at nukleinsyrer utvinnes fra FFPE vev har gjennomgått alvorlige fysiske skader og kjemiske modifikasjoner, som gjør sin analyse vanskelig og krever tilpasset analyser. MicroRNAs (miRNAs), men som representerer en liten klasse av RNA molekyler som dekker bare opp til ~ 18 – 24 nukleotider, har vist seg å tåle langtidslagring og har vært vellykket analysert i FFPE prøver. Her presenterer vi en 3 barcoded komplementære DNA (cDNA) bibliotek forberedelse protokoll spesielt optimalisert for analyse av små RNAs Hentet fra arkiverte vev, som nylig ble vist for å være robust og svært reproduserbar når bruker arkivert klinisk prøver lagret for opp til 35 år. Dette biblioteket preparatet er godt tilpasset multiplex analyse av kompromittert/degradert materiale der RNA prøver (opptil 18) er samskrevet med personlige 3′ barcoded kort og deretter samlet sammen for påfølgende enzymatisk og biokjemiske forberedelser før analyse. Alle renselser utføres av polyakrylamid gel geleelektroforese (side), hvilke innrømmer størrelse-spesifikke valg og enrichments barcoded liten RNA arter. Dette cDNA biblioteket preparatet er godt tilpasset til minutt RNA innganger, som en pilot polymerasekjedereaksjons (PCR) tillater fastsetting av en bestemt forsterkning syklus å produsere optimale mengder materiale for neste generasjons sekvensering (NGS). Denne tilnærmingen ble optimalisert for bruk av dårligere FFPE fra prøver arkivert for opp til 35 år og gir svært reproduserbar NGS data.
Introduction
miRNAs er bemerkelsesverdig godt bevart i formalin-fast parafin-embedded (FFPE) prøver1,2,3. Tidligere arbeid har vist at uttrykket av disse korte regulatoriske ikke-koding enkelt strandet RNA molekyler kan evalueres vellykket med totalt RNA fra FFPE prøver og gi relevant genuttrykk data i forhold til den opprinnelige friskt vev4,5,6,7,8. Sammenlignet med stor størrelse messenger RNAs, som har vist seg å være kritisk påvirket av FFPE vev behandling (formaldehyd, varme, uttørking, etc.), endogen RNases, og alderen av prøver, den lille størrelsen på miRNAs (~ 18-24 nukleotider) synes å gjøre dem motstandsdyktig mot nedbrytning og elastisk for langvarig lagring, viste også gjennom miRNA uttrykk studier som overgår høy gjennomstrømming mRNA studier i arkiverte prøver9. miRNA uttrykk studier med arkiverte klinisk prøver, som er hovedsakelig utført i småskala analyser, har vist at enkelt eller multiplekset kvantitative PCR analyser, ulike typer microarray teknologi og sist NGS kan brukes til å vurdere uttrykk for bevarte miRNAs etter optimalisering av disse analyser10,11,12,13,14.
Gitt at feilregulering miRNA uttrykk har vært forbundet med utvikling av en rekke menneskelige malignitet, og at det er potensielt en enorm tilførsel av klinisk kommenterte arkiverte prøver, det er blitt klart at disse små RNA molekyler er en lovende kilde til potensielle kreft biomarkers15,16,17,18. Bruk av en høy gjennomstrømming gene expression teknologi som NGS har fordelen av å gi en global evaluering av alle miRNA transkripsjoner sammenlignet med målrettet teknologier som PCR og/eller microarrays19. Derfor var en optimalisert, rimelig og enkelt gjeldende protokoll for cDNA biblioteket utarbeidelse av små RNAs fra eldre arkiverte prøver for NGS optimalisert for å aktivere store retrospektiv studier20.
Vi etablerte en samtidige RNA/DNA utvinning protokoll for egen utvinning av RNA og DNA fra eldre arkiverte prøver, som vi fant for å utkonkurrere moderne kommersielle kits21. Bruker denne utvinning protokollen, hente totalt RNA fra FFPE vev arkivert for lengre tid, optimalisert vi utarbeidelsen av cDNA biblioteker for NGS av miRNAs bevart i klinisk prøver for opp til 35 år. Videre, i en nylig publisert studie hvor vi forberedt cDNA biblioteker fra klinisk klassifisert ductal karsinom i situ (DCIS) eksemplarer, vi identifisert ulikt uttrykt miRNAs som ble godkjent av kvantitative PCR, som indikert at bestemte miRNA uttrykk endringer kan være i DCIS lesjoner fra pasienter som utvikler brystkreft i forhold til DCIS lesjoner fra pasienter som ikke utvikle brystkreft.
Vurderer kostnadene for kommersielle kits for utarbeidelse av små RNA cDNA biblioteker, potensialet for deres seponering, samt bruk av copyright/patent-beskyttet reagenser som ikke kan optimaliseres, bestemte vi oss å tilpasse en tidligere publisert laboratorie-baserte og kit-gratis 3′ barcoded cDNA biblioteket forberedelse protokoll for NGS av små RNAs arkivert i FFPE eksemplarer, slik at samtidig analyse av 18 eksempler22. Denne protokollen gir en ideell og robust fremgangsmåte visuelle og tekniske evalueringen sjekkpunkter, som var kritiske for tilpasning til FFPE RNA prøver, og har en sterk potensial for søknad til andre kilder til kompromittert eller vanskelig bruke RNA materiale. Opprinnelige protokollen anvendbarhet ble forbedret ved å erstatte radioactively merket størrelse markører med fluorescerende (f.eksSYBR gull) synlig RNA størrelse markører brukes under utvalg av samskrevet bibliotekene på store polyakrylamid gels. Denne optimaliserte protokollen avhengig ligation av 3 barcoded adaptere for 18 individuelle FFPE RNA prøver, som er så samlet sammen for å gjennomgå 5 kort hemorroider, omvendt-transkripsjon og en pilot PCR analyse for skreddersydd forsterkning av den siste cDNA biblioteket før store PCR forsterkning rensing og NGS på en høy gjennomstrømning sequencer.
Protocol
Representative Results
Discussion
En svært reproduserbare og robust cDNA biblioteket forberedelse protokoll for NGS av små RNAs arkivert i FFPE RNA prøver er presentert i denne protokollen, som er en modifisert og optimalisert versjon prosedyren beskrevet av Hafner et al. 22
Alle trinnene i denne protokollen er optimalisert for bruk med eldre arkiverte og kompromittert totale RNA utvinnes fra FFPE eksemplarer. Det viktigste trinnet i denne protokollen, for behandling av små mengder av FFPE …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Thomas Tuschl, leder av laboratorium for RNA molekylærbiologi og medlemmer av hans laboratorium for deres støtte og for å dele teknologien utviklet i laboratoriet og gir tilgang til rørledningen RNAworld. Vi takker også Dr. Markus Hafner for sin protokoll og gir detaljerte beskrivelser på alle biokjemiske og enzymatiske trinnene i hans første prosedyren.
Materials
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt ladder | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml Bovine Serum Albumine | Sigma | B8894-5ML | |
| 50X Titanium Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | 7727-54-0 | |
| BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs | GIBCO | V16 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424R | USA scientific | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | USA scientific | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Gel Breaker Tube 0.5 ml | IST Engineering Inc, | 3388-100 | |
| Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge dual rotor personal centrifuge | USA scientific | 2641-0016 | |
| Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers | Ciore Life Science | 21070010 | |
| Oligonucleotides | IDT | Defined during order | |
| Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Restriction enzyme PmeI | NEB | R0560S | |
| RNase-free water | Ambion | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 blue light transilluminator | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler with heated lid | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer | National Diagnostics | EC-833 |
References
- Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
- Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure–DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
- Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10 (6), e0129338 (2015).
- Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
- Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
- Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
- Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
- Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8 (5), e64393 (2013).
- Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
- Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
- Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
- Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
- Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).
- Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
- Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
- Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
- Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
- Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
- Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
- Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7 (4), e34683 (2012).
- Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 164-170 (2012).
- Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).
