CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias
Summary
Aquí, describimos los métodos para realizar ChIP-Seq y mapas de CARIP-Seq, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación, generar global epigenómica y RNA asociada a la cromatina en células madre embrionarias.
Abstract
Auto-renovación de células madre embrionarias (ES) y diferenciación se rige por señales extrínsecas e intrínsecas redes de factores de transcripción, reguladores epigenéticos y traducción posteriores modificaciones de las histonas que influyen combinatorially en el gene Estado de expresión de los genes cercanos. RNA se ha demostrado también al interactuar con diversas proteínas para regular la dinámica de la cromatina y expresión génica. Asociada a la cromatina RNA inmunoprecipitación (CARIP) seguida por secuenciación de próxima generación (CARIP-Seq) es un método novedoso para la encuesta de ARN asociado a proteínas de cromatina, mientras que de inmunoprecipitación de cromatina, seguida por secuenciación de próxima generación ( ChIP-Seq) es una técnica poderosa genómica para asignar la ubicación de modificaciones post-traduccionales de las histonas, factores de transcripción y epigenéticos modificadores a escala mundial en células madre embrionarias. Aquí, describimos los métodos para realizar CARIP-Seq y ChIP-Seq, incluyendo la construcción de la biblioteca para secuenciación de próxima generación, para generar ARN cromatina asociado global y mapas epigenómicos en células madre embrionarias.
Introduction
Las decisiones de destino de células madre embrionarias (ES) son reguladas por la comunicación entre las señales extracelulares y un anfitrión de transcripcional reguladores, como modificadores de histonas, modificación post traducción de colas de las histonas. Estas interacciones facilitan la accesibilidad de la cromatina y empaquetado de la cromatina en uno de dos Estados: eucromatina, que es abierto y transcripcionalmente activo, y la heterocromatina, que es compacto y generalmente transcripcionalmente inactiva. Factores de transcripción con afinidades de unión de la secuencia específica de ADN y modificadores epigenéticos asociados con regiones euchromatic para participar en el control de la expresión génica. Métodos de secuenciación de próxima generación, incluyendo ChIP-Seq1, han sido fundamentales en la asignación de redes transcripcionales del genoma que son fundamentales para ES celular auto renovación y pluripotencia2,3,4 ,5,6. Por otra parte, mientras que immunopreciation RNA seguido por generación de secuenciación (RIP-Seq)7 las evaluaciones de las interacciones RNA-proteína sugieren que proteínas ADN interactuarán con RNAs regulación transcripcional eventos7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, pocos estudios han investigado la localización de todo el genoma de ARN asociado con cromatina12o interacciones globales entre el ARN y la histona modificación. ARN largo no codificante (lncRNAs) es una clase de RNAs que se han encontrado para regular la actividad de las proteínas asociadas a cromatina13,14,15. Por ejemplo, Xist es un lncRNA que regula, en células de mamífero femenino, la inactivación de un cromosoma de X, a través de la contratación de represores epigenéticos16,17. Sin embargo, el espectro completo de RNAs asociados con cromatina es desconocido. Aquí, describimos un protocolo nuevo, asociada a la cromatina RNA inmunoprecipitación (CARIP) seguida por secuenciación de próxima generación (CARIP-Seq), para identificar ARN cromatina asociados sobre una base de todo el genoma en células madre embrionarias, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación y ChIP-Seq mapa ocupación global de modificaciones de las histonas, factores de transcripción y modificadores de la epigenéticos. A diferencia de otros métodos de RIP-Seq7, CARIP-Seq incluye pasos de reticulación y sonicación, que permiten la identificación directa de ARN asociada a la cromatina. Juntos, ChIP-Seq es una poderosa herramienta para identificar las interacciones de la proteína del genoma-ADN, mientras que CARIP-Seq es un método poderoso para RNAs asociados con componentes de la cromatina.
Protocol
Representative Results
Discussion
ChIP-Seq es un método útil para evaluar la situación de las interacciones proteína-ADN global (por ej., factores de transcripción/histona modificación de enzimas/histona modificaciones y ADN) en células madre embrionarias, mientras que el nuevo protocolo de CARIP-Seq es útil en interrogatorio de Asociación de genoma de ARN con los componentes de la cromatina. ChIP-Seq es una herramienta fundamental que se utiliza para evaluar paisaje epigenético de células madre embrionarias y otros tipos de células….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por Wayne estado Universidad, Karmanos Cancer Institute, una beca de la National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01A1) a B.L.K. Este trabajo utiliza el Wayne estado Universidad alto rendimiento Computación Grid de recursos computacionales (). Agradecemos Jiji Kurup ayuda con análisis de datos de CARIP-Seq.
CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES:
B.L.K. concibió el método de CARIP-Seq, diseñado y llevado a cabo los experimentos de ChIP-Seq y CARIP-Seq, analizó los datos de secuenciación y redactó el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado la versión final de este manuscrito.
Materials
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
Riferimenti
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