CARIP-Seq og ChIP-Seq: metoder for å identifisere Chromatin-assosiert RNAs og Protein-DNA interaksjoner i embryonale stamceller
Summary
Her beskriver vi metoder for å utføre ChIP-Seq og CARIP-Seq, inkludert biblioteket forberedelse til neste generasjons sekvensering, genererer globale epigenomic og chromatin-assosiert RNA kart i ES celler.
Abstract
Embryonic stem (ES) celle selvtillit fornyelse og differensiering er underlagt ytre signaler og iboende nettverk av transkripsjonsfaktorer epigenetic regulatorer og post oversettelse modifikasjoner av histones som påvirker combinatorially genet uttrykket delstaten nærliggende gener. RNA har også vist seg å samhandle med ulike proteiner å regulere chromatin dynamikk og genuttrykk. Chromatin-assosiert RNA immunoprecipitation (CARIP) etterfulgt av neste generasjons sekvensering (CARIP-Seq) er en ny metode for undersøkelse RNAs tilknyttet chromatin proteiner, mens chromatin immunoprecipitation etterfulgt av neste generasjons sekvensering ( ChIP-Seq) er en kraftig genomics teknikk å kartlegge plasseringen av post-translasjonell modifikasjon av histones og transkripsjonsfaktorer epigenetic modifikatorer på en global skala i ES celler. Her beskriver vi metoder for å utføre CARIP-Seq og ChIP-Seq, inkludert biblioteket konstruksjon for neste generasjons sekvensering, vil generere globale chromatin-assosiert RNA og epigenomic kart i ES celler.
Introduction
Embryonic stem (ES) cellen skjebne beslutninger er regulert av kommunikasjon mellom ekstracellulære signaler og en rekke transcriptional-regulatorer, inkludert histone bestemmelsesord og post oversettelse modifikasjon av histone haler. Disse interaksjoner lette chromatin tilgjengelighet og pakking av chromatin inn i én av to måter: euchromatin, som er åpen og transcriptionally aktive, og heterochromatin, som er kompakt og generelt transcriptionally inaktive. Transkripsjonsfaktorer med DNA sekvens-spesifikke bindende slektskap og epigenetic modifikatorer forbinder med euchromatic regioner til å delta i å kontrollere genuttrykk. Neste generasjons sekvensering metoder, inkludert ChIP-Seq1, har vært medvirkende i kartlegging genomet hele transcriptional nettverk som er grunnleggende for ES celle selvtillit fornyelse og pluripotency2,3,4 ,5,6. Videre mens RNA immunopreciation etterfulgt av neste generasjons sekvensering (RIP-Seq)7 evalueringer av RNA-protein interaksjoner foreslå at DNA bindende proteiner samhandle med RNAs å regulere transcriptional hendelser7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, få studier har undersøkt genomet hele lokalisering av RNAs knyttet til chromatin12eller globale samspillet mellom RNA og histone modifikasjoner. Lenge ikke-koding RNAs (lncRNAs) er en klasse av RNAs som har blitt funnet for å regulere aktiviteten til chromatin-assosiert proteiner13,14,15. Xist er for eksempel et lncRNA som regulerer, i kvinnelige pattedyrceller, inaktivering av en X-kromosom, gjennom rekruttering av epigenetic repressors16,17. Men er hele spekteret av RNAs forbundet med chromatin hovedsakelig ubekjent. Her beskriver vi en ny protokoll, chromatin-assosiert RNA immunoprecipitation (CARIP) etterfulgt av neste generasjons sekvensering (CARIP-Seq), til å identifisere chromatin-assosiert RNAs på genomet-bred basis i ES celler, inkludert biblioteket forberedelse for neste generasjons sekvensering, og ChIP-Seq tilordne globale belegget av histone modifikasjoner og transkripsjonsfaktorer epigenetic modifikatorer. I motsetning til andre RIP-Seq metoder7inkluderer CARIP-Seq crosslinking og sonication skritt, som tillater direkte identifisering av RNAs med chromatin. Sammen, ChIP-Seq er et kraftig verktøy for å identifisere genomet hele protein-DNA interaksjoner, mens CARIP-Seq er en kraftig metode å kartlegge RNAs forbundet med chromatin komponenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
ChIP-Seq er en nyttig metode for å vurdere plasseringen av globale protein-DNA samhandlinger (f.eks., transkripsjon faktorer/histone endre enzymer/histone modifikasjoner og DNA) i ES celler, mens den nyutviklede CARIP-Seq-protokollen er nyttig i forhøre genomet-bred sammenslutning av RNAs med chromatin bestanddeler. ChIP-Seq er et grunnleggende verktøy som brukes til å evaluere epigenetic landskap av ES celler og andre celletyper. Kvaliteten på ChIP-Seq og CARIP-Seq biblioteker er i stor grad avhengig av Ch…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, et stipend fra National hjerte, lunge og blod Institute (1K22HL126842-01A1) til B.L.K. Dette arbeidet utnyttet Wayne State University høy ytelse Computing rutenettet for beregningsressurser (). Vi takker Jiji Kurup for hjelp med CARIP-Seq dataanalyse.
FORFATTERNES BIDRAG:
B.L.K. unnfanget av metoden CARIP-Seq, utformet og utført av ChIP-Seq og CARIP-Seq eksperimenter, analysert sekvensering dataene og utarbeidet manuskriptet. Alle forfattere har lest og godkjent den endelige versjonen av dette manuskriptet.
Materials
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
Riferimenti
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center’s improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
