Levator Auris Longus Preparazione per l'esame della trasmissione neuromuscolare dei mammiferi sotto condizioni di morsetto di tensione
Summary
Il protocollo descritto in questo documento utilizza il muscolo di longus di levator auris (LAL) del mouse per registrare spontanea e nervo-evocata potenziali postsinaptici (corrente-clamp) e correnti (tensione-clamp) alla giunzione neuromuscolare. Utilizzo di questa tecnica può fornire spunti chiave nei meccanismi della trasmissione sinaptica in condizioni normali e malattia.
Abstract
Questo protocollo descrive una tecnica di trasmissione sinaptica record dalla giunzione neuromuscolare in condizioni di corrente- e tensione-morsa. Una preparazione ex vivo di levator auris longus (LAL) è usata perché è un muscolo sottile che fornisce una visualizzazione semplice della giunzione neuromuscolare per impalamento microelettrodo presso il terminale del motoneurone. Questo metodo consente la registrazione dei potenziali spontanei miniatura della piastra laterale e correnti (mEPPs e mEPCs), i potenziali evocati del nervo della piastra laterale e correnti (EPPs ed EPCs), come pure le proprietà della membrana dei motoneurone. Risultati ottenuti da questo metodo includono il contenuto quantal (QC), numero di siti di rilascio delle vescicole (n), probabilità di rilascio delle vescicole (prel), facilitazione sinaptica e depressione, nonché la costante di tempo della membrana muscolare (τ m) e la resistenza di ingresso. Applicazione di questa tecnica di modelli murini di malattia umana può evidenziare patologie chiave negli Stati di malattia e aiutare a identificare nuove strategie terapeutiche. Dal completamente tensione-serraggio di una singola sinapsi, questo metodo fornisce una delle analisi più dettagliate della trasmissione sinaptica attualmente disponibili.
Introduction
Studiando la trasmissione sinaptica alla giunzione neuromuscolare fornisce approfondimenti il rapporto dinamico tra i sistemi nervosi e scheletrici muscolari ed è un eccellente modello per l’esame di fisiologia sinaptica. Il levator auris longus (LAL) è un muscolo sottile, permettendo per le giunzioni neuromuscolari possano essere facilmente visualizzati. Rapporti precedenti hanno descritto la convenienza di usando il LAL per esaminare le tossine e droghe sinaptiche e hanno caratterizzato le caratteristiche del tipo di fibra muscolare scheletrica del leone1,2. Numerosi studi hanno utilizzato la LAL per esaminare la fisiologia neuromuscolare3,4,5,6,7,8. Per elettrofisiologia, la capacità di osservare facilmente giunzioni neuromuscolari LAL consente il posizionamento accurato dei microelettrodi presso il terminale del motoneurone e riduce notevolmente i problemi di spazio morsetto in registrazione trasmissione sinaptica. Corrente-morsetto registrazioni delle proprietà di membrana del muscolo, come la costante di tempo della membrana (τm) e la resistenza di ingresso (Ra) sono facilmente ottenute. Inoltre, queste proprietà possono essere misurate da fibre del muscolo stesse utilizzate per registrare la trasmissione neuromuscolare, consentendo un confronto diretto della funzione sinaptica per le proprietà della membrana muscolare. Analisi di questi dati può fornire spunti preziosi per i meccanismi fisici di molte malattie neuromuscolari e Stati di attività alterata.
Un aspetto fondamentale della tecnica qui descritta è l’uso di tensione-morsetto per registrazioni sinaptiche, che non sono soggetti alla non-linearità incontrate nella corrente-morsetto e sono indipendenti le proprietà della membrana muscolare. Vantaggi dell’utilizzo di tensione-morsetto al contrario di corrente-morsetto per esaminare la trasmissione neuromuscolare sono stati stabiliti dai pionieristici sforzi nel 1950s9. Sotto corrente-pinza, EPPs che superano i 10-15 mV in ampiezza non sono un prodotto lineare della ampiezza mEPP9. Ad esempio, se la media mEPP è 1 mV, un PPE di 5 mV può presumere di essere il prodotto di 5 mEPPs (QC di 5); considerando che, un PPE di 40 mV sarà il prodotto di più di 40 mEPPs. Questa non-linearità alle più grandi EPPs si verifica perché la forza motrice per il PPE, che è la differenza tra il potenziale di membrana e il potenziale di equilibrio per il recettore dell’acetilcolina (~ -10 mV), sostanzialmente diminuisce durante grande EPPs. Questo problema è evitato in esperimenti di tensione-clamp perché il potenziale di membrana muscolare non cambia durante gli esperimenti di tensione-morsetto. Uno svantaggio è che esperimenti di tensione-clamp sono tecnicamente più difficili rispetto a quello che di registrazione corrente-morsetto. Con questo in mente, McLachlan e Martin ha sviluppato una semplice correzione matematica che rappresenta il non-linearità in corrente-morsetto registrazioni di EPPs10. Le correzioni funzionano bene11,12,13, ma la cosa importante, si supponga che le proprietà della membrana muscolare non sono stati interrotti.
Le proprietà della membrana muscolare sono particolarmente importante considerare se studiando condizioni o Stati di malattia che interrompono il muscolo. Ad esempio, il muscolo scheletrico da R6/2 modello transgenico della malattia di Huntington è hyperexcitable a causa di una progressiva riduzione nel riposo cloruro e potassio correnti14,15. Di conseguenza, mEPPs ed EPPs sono amplificati nel muscolo scheletrico R6/2. Certamente, i fattori supplementari possono alterare mEPPs ed EPPs. Lavorare con un modello diverso di topi del morbo di Huntington (R6/1) trovato modifiche EPPs che sembravano essere legati a proteine SNARE8. Per valutare i meccanismi che causano la trasmissione neuromuscolare alterata, sarebbe utile eliminare gli effetti di proprietà della membrana muscolare alterata tramite un morsetto di tensione. In uno studio recente, la trasmissione neuromuscolare R6/2 è stata studiata sotto entrambe le condizioni di corrente e tensione morsetto utilizzando la tecnica descritta nel presente documento. La totalità delle piastre laterali motore erano tensione-premuta con meno di 1% errore inserendo due microelettrodi all’interno la costante di lunghezza della placca motrice16. E ‘ stato quel morsetto di tensione corretti record corrente-morsetto ha reso a contrasto misurazioni della trasmissione neuromuscolare nel muscolo R6/2. Ciò evidenzia che può essere difficile da correggere EPPs per non-linearità, se sono state modificate le proprietà della membrana muscolare e Mostra i benefici di ottenere record di tensione-morsetto che sono indipendente dalle proprietà della membrana muscolare. Il protocollo presentato qui è ideale per l’esame di condizioni o patologie che influiscono sulla trasmissione sinaptica e le proprietà della membrana postsinaptica.
Protocol
Representative Results
Discussion
È descritto qui la preparazione e l’uso del mouse del muscolo LAL per la misura della trasmissione neuromuscolare in condizioni di corrente o tensione morsetto. Ci sono diversi punti importanti da considerare per la dissezione fuori il LAL. Pulizia del tessuto connettivo in eccesso l’AIDS di muscolo in impalamento elettrodo, come gli elettrodi riesci a scroccare il tessuto connettivo quando loro posizionamento per impalamento. Tuttavia, rimuovere solo il tessuto connettivo che può essere tolto facilmente per limitare l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringraziano il Dr. Mark M. Rich e Daniel Miranda per Commenti editoriali, Ahmad Khedraki per aiutare a stabilire questa tecnica e Wright State University per il sostegno finanziario (fondo di avvio per A.A.V.).
Materials
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Axoclamp 900A Amplifier | Molecular Devices | 2500‐0179 | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher | |
Riferimenti
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscienze. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington’s mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington’s Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. . The anatomy of the rat. , (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. . Electric current flow in excitable cells. , (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscienze. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
