Levator Auris Longus Forberedelse for undersøkelse av pattedyr nevromuskulær overføring Under spenning klemme forhold
Summary
Protokollen beskrevet i dette dokumentet bruker musen levator auris longus (LAL) muskler registrere spontan og nerve-utløste postsynaptic potensialer (gjeldende-klemme) og strøm (spenning-klemme) i nevromuskulær krysset. Bruk av denne teknikken kan gi viktig innsikt i mekanismer av synaptic overføring under normal og sykdom.
Abstract
Denne protokollen beskriver en teknikk posten synaptic overføring fra nevromuskulær krysset under gjeldende-klemme og spenning-klemme forhold. En ex vivo utarbeidelse av levator auris longus (LAL) brukes fordi det er en tynn muskel som gir enkel visualisering av nevromuskulær krysset microelectrode impalement på motor endplate. Denne metoden gjør opptak av spontane miniatyr endplate potensialer og strøm (mEPPs og mEPCs), nerve-utløste endplate potensialer og strøm (EPPs og EPCs), samt egenskapene membran motor endplate. Resultatene fra denne metoden inkluderer det quantal innholdet (QC), antall vesicle release nettsteder (n), sannsynligheten for vesicle utgivelsen (prel), synaptic tilrettelegging og depresjon, samt muskel membran tiden konstant (τ m) og input motstand. Bruk av denne teknikken til musen modeller for menneskelig sykdom kan markere viktige patologi i sykdom stater og identifisere romanen behandling strategier. Fullt spenning-klemanordning en enkelt synapse gir denne metoden en av de mest detaljerte analysene av synaptic overføring tilgjengelig.
Introduction
Studere synaptic overføring i nevromuskulær krysset gir innsikt i dynamiske forholdet mellom nervøs og skjelettlidelser muskel-systemer og er en utmerket modell for å undersøke synaptic fysiologi. Levator auris longus (LAL) er en tynn muskel, slik at de nevromuskulær Forbindelsesstykke å være lett å visualisere. Tidligere rapporter har beskrevet bruke LAL undersøke synaptic narkotika og giftstoffer og har preget de skjelettlidelser muskel fiber egenskapene av LAL1,2. Tallrike studier har brukt LAL undersøke nevromuskulær fysiologi3,4,5,6,7,8. For elektrofysiologi, muligheten til å observere LAL nevromuskulær veikryss gir nøyaktig plassering av microelectrodes på motor endplate og reduserer klemme plassproblemer i innspillingen synaptic overføring. Gjeldende-klemme opptak av muskel membran egenskapene som membran tidskonstant (τm) og inngang motstand (Ri) er lett oppnådd. Disse egenskapene kan videre måles fra samme muskelfibre brukes til å registrere nevromuskulær overføring, slik at for en direkte sammenligning av synaptiske funksjon i muskel membran egenskapene. Analyse av disse dataene gir innblikk i de fysiske mekanismene av mange neuromuscular sykdommen og USA endret aktivitet.
Et viktig aspekt av teknikken beskrevet her er bruk av spenning-klemme for synaptic innspillinger, som er ikke underlagt de ikke-lineære funksjonene i gjeldende-klemme og er uavhengig av egenskapene muskel membran. Fordeler ved spenning-klemme i motsetning til gjeldende-klemme undersøke nevromuskulær overføring ble etablert av banebrytende innsats i 1950-tallet9. Under gjeldende-klemme er EPPs som overskrider 10-15 mV i amplitude ikke en lineær produkt av mEPP amplitude9. For eksempel, hvis den gjennomsnittlige mEPP 1 mV, en EPP 5 mV kan antas for å være av 5 mEPPs (QC 5); mens en EPP 40 mV blir produktet av mer enn 40 mEPPs. Denne ikke-linearitet på større EPPs oppstår fordi drivkraft for EPP, som er forskjellen mellom membran potensialet og likevekt potensial for acetylcholin reseptor (~ -10 mV), vesentlig synker under store EPPs. Dette problemet unngås spenning-klemme eksperimenter fordi muskel membran potensialet ikke endres under spenning-klemme eksperimenter. En ulempe er at spenningen-klemme eksperimenter er teknisk vanskelig å fullføre enn gjeldende-klemme opptak. Med dette i bakhodet utviklet McLachlan og Martin en enkel matematisk korreksjon som står for ikke-lineære funksjonene i gjeldende-klemme innspillinger av EPPs10. Rettelsene fungerer bra11,12,13, men viktigere, antar at muskel membran egenskapene ikke er avbrutt.
Muskel membran egenskapene er spesielt viktig å vurdere om studere forhold eller sykdom stater som forstyrrer muskelen. For eksempel er Skjelettmuskel fra R6/2 transgene modellen av Huntingtons sykdom hyperexcitable på grunn av en gradvis reduksjon i hvile klorid og kalium strøm14,15. Som en konsekvens, er mEPPs og EPPs forsterket i R6/2 skjelettmuskelen. Flere faktorer kan sikkert, endre mEPPs og EPPs. Arbeide med en annen modell av Huntingtons sykdom mus (R6/1) fant endringer i EPPs som syntes å være relatert til SNARE-proteiner8. For å vurdere mekanismer forårsaker endret nevromuskulær overføring, ville det være gunstig å eliminere effektene av endrede muskel membran egenskaper ved hjelp av en spenning-klemme. I en fersk studie, ble R6/2 nevromuskulær overføringen studert under både gjeldende – og spenning-klemme forhold ved hjelp av teknikken beskrevet heri. Helheten av motor endplates var spenning-festet med mindre enn 1% feilen ved å plassere to microelectrodes i lengde konstant endplate16. Det ble vist at spenningen-klemme og korrigert gjeldende-klemme poster gitt kontrasterende målinger av nevromuskulær overføring i R6/2 muskel. Dette understreker at det kan være vanskelig å korrigere EPPs for ikke-lineære funksjonene Hvis egenskapene muskel membran har endret og viser fordelene ved å få spenning-klemme poster som er uavhengige av muskel membran egenskapene. Protokollen presenteres her er ideelt for å undersøke forhold eller sykdom stater som påvirker synaptic overføring og egenskapene postsynaptic membran.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet her er forberedelse og bruk av musen LAL muskel for måling av nevromuskulær overføring under gjeldende – eller spenning-klemme forhold. Det er flere viktige punkter å vurdere for dissekere ut av LAL. Rengjøring overflødig bindevev muskel AIDS i elektrode impalement, som elektrodene kan ulempe bindevevet når posisjonering dem for impalement. Imidlertid bare fjerne bindevev som kan tas bort lett å begrense sjansene for skade muskelen. Isolasjon av nerve bør utføres med forsiktighet, fordi det er veldig …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Mark M. Rich og Daniel Miranda for redaksjonelle kommentarer, Ahmad Khedraki for å hjelpe etablere denne teknikken, og Wright State University for økonomisk støtte (oppstart fondet til A.A.V.).
Materials
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Axoclamp 900A Amplifier | Molecular Devices | 2500‐0179 | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher | |
Riferimenti
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscienze. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington’s mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington’s Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. . The anatomy of the rat. , (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. . Electric current flow in excitable cells. , (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscienze. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
