Levator Auris Longus Förberedelse för undersökning av däggdjur neuromuskulär Transmission spänningen klämman villkor
Summary
Protokollet beskrivs i detta dokument använder mus levator auris longus (LAL) muskeln att spela in spontana och nerv-framkallat postsynaptiska potentialer (ström-clamp) och strömmar (spänning-clamp) vid den neuromuskulära förbindelsen. Användningen av denna teknik kan ge viktiga insikter i mekanismer av synaptisk transmission under normal- och sjukdom.
Abstract
Det här protokollet beskriver en teknik att registrera synaptisk transmission från den neuromuskulära förbindelsen ström-klämma och spänning-clamp villkor. En ex vivo -förberedelse av levator auris longus (LAL) används eftersom det är en tunn muskel som ger enkel visualisering av den neuromuskulära förbindelsen för mikroelektrod impalement på den motoriska endplate. Denna metod tillåter inspelning av spontana miniatyr endplate potentialer och strömmar (mEPPs och mEPCs), nerv-framkallat endplate potentialer och strömmar (EPPs och EPCs), samt den motoriska endplate membran egenskaper. Resultat från denna metod inkluderar kvantfysikaliska innehållet (QC), antalet vesikler release webbplatser (n), sannolikheten för vesikler release (prel), synaptic underlättande och depression, samt muskel membran tidskonstanten (τ m) och ingångs inresistans. Tillämpningen av denna teknik till musmodeller av mänskliga sjukdomar kan belysa viktiga patologier i sjukdomstillstånd och identifiera nya behandlingsstrategier. Av fullt spänning-fastspänning en enda synaps, ger denna metod en av de mest detaljerade analyserna av synaptisk transmission för närvarande tillgängliga.
Introduction
Studera synaptisk transmission vid den neuromuskulära förbindelsen ger insikter om dynamiska relationen mellan nervsystemet och skelettet muskulös system och är en utmärkt modell för att pröva synaptic fysiologi. Den levator auris longus (LAL) är en tunn muskel, möjliggör de neuromuskulära korsningarna att visualiseras enkelt. Tidigare rapporter har beskrivit använda LAL undersöka synaptic droger och toxiner och har präglat de skeletala muskelfiber typ egenskaperna av LAL1,2. Många studier har använt LAL för att undersöka neuromuskulär fysiologi3,4,5,6,7,8. För elektrofysiologi, möjlighet att enkelt följa LAL neuromuskulära korsningar tillåter för korrekt placering av mikroelektroder på den motoriska endplate samt reducerar kraftigt klämma rymdfrågor i inspelningen synaptisk transmission. Aktuellt-clamp inspelningar av muskel membran egenskaper, såsom membran tidskonstant τ (m) och Ingångsmotstånd (Ri) erhålls lätt. Dessa egenskaper kan dessutom mätas från samma muskelfibrer används för att registrera neuromuskulär transmission, vilket möjliggör en direkt jämförelse av synaptic funktion till muskel membran egenskaper. Analys av dessa data kan ge viktiga insikter i de fysiska mekanismerna för många neuromuskulära sjukdomar och påstår av förändrad verksamhet.
En viktig aspekt av den teknik som beskrivs här är användningen av spänning-klämma för synaptic inspelningar, som inte omfattas av de icke-linjära stött i ström-klämma och är oberoende av muskel membran egenskaper. Fördelarna med att använda spänning-klämma i motsats till nuvarande-clamp för att undersöka neuromuskulär transmission fastställdes genom banbrytande insatser i 1950-talet9. Under nuvarande-klämma är EPPs som överskrider 10-15 mV i amplitud inte en linjär produkt av fredsprocessen amplitud9. Till exempel, om den genomsnittliga fredsprocessen är 1 mV, en EPP 5 mV kan antas vara produkten av 5 mEPPs (QC 5); medan en EPP 40 mV kommer att vara en produkt av mer än 40 mEPPs. Denna icke-linjäritet på större EPPs uppstår eftersom den drivande kraft för EPP, som är skillnaden mellan membranet potential och jämvikt potential för acetylkolin receptorn (~ -10 mV), väsentligen minskar under stora EPPs. Problemet undviks i spänning-clamp experiment eftersom muskel membranpotentialen inte ändras under spänning-clamp experiment. En nackdel är att spänning-clamp experiment är tekniskt svårare att slutföra än nuvarande-clamp inspelning. Med detta i åtanke utvecklat McLachlan och Martin en enkel matematisk korrigering som står för icke-linjära i ström-clamp inspelningar av EPPs10. Korrigeringarna fungerar bra11,12,13, men ännu viktigare, antar att muskel membran egenskaper inte störts.
De muskel membran egenskaperna är särskilt viktigt att överväga om studera villkor eller sjukdomstillstånd som stör muskeln. Skelettmuskulaturen från R6/2 transgena modell av Huntingtons sjukdom är exempelvis hyperexcitable på grund av en gradvis minskning i vilande klorid och kalium strömmar14,15. Följaktligen, förstärks mEPPs och EPPs i R6/2 skelettmuskulaturen. Visst, ytterligare faktorer kan förändra mEPPs och EPPs. Arbeta med en annan modell av HS möss (R6/1) Funna förändringar i EPPs som verkade vara relaterade till SNARA-proteiner8. För att bedöma de mekanismer som orsakar förändrad neuromuskulär transmission, skulle det vara fördelaktigt att eliminera effekterna av förändrade muskel membran egenskaper med hjälp av en spänning-klämma. I en färsk studie studerades den R6/2 neuromuskulär transmissionen villkor både ström – och spänning-klämma med den teknik som beskrivs häri. Helheten av den motoriska gavlar var spänning-fastklämd med mindre än 1% fel genom att placera två mikroelektroder inom konstanten längd av endplate16. Det visades att spänning-klämma och korrigerade ström-clamp records gav kontrasterande mätningar av neuromuskulär transmission i R6/2 muskel. Detta belyser att det kan vara svårt att korrigera EPPs för icke-linjära om muskel membran egenskaper har ändrats och visar fördelarna med att få spänning-clamp-poster som är oberoende av muskel membran egenskaper. Det protokoll som presenteras häri är idealisk för att undersöka villkor eller sjukdomstillstånd som påverkar synaptisk transmission och postsynaptiska membran egenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrivs här är utarbetandet och användningen av musen LAL muskel för mätning av neuromuskulär transmission ström – eller spänning-clamp villkor. I området i närheten finns det flera viktiga punkter att överväga inför dissekera ut LAL. Rengöring överflödig bindväv från muskler aids i elektroden impalement, som elektroderna kan haffa bindväv när positionering dem för impalement. Dock bara ta bort bindväv som kan tas bort enkelt att begränsa risken för skada muskeln. Isolering av nerven bör utföra…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Mark M. Rich och Daniel Miranda för redaktionella kommentarer, Ahmad Khedraki för att hjälpa upprätta denna teknik, och Wright State University för finansiellt stöd (start fond till A.A.V.).
Materials
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Axoclamp 900A Amplifier | Molecular Devices | 2500‐0179 | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher | |
Riferimenti
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neuroscienze. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington’s mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington’s Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. . The anatomy of the rat. , (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. . Electric current flow in excitable cells. , (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neuroscienze. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
