Количественная оценка внутриклеточных роста внутри макрофагов является быстрый и надежный метод оценки вирулентности лейшмании паразитов
Summary
Все патогенных видов Leishmania проживают и репликацию внутри макрофагов их позвоночных хозяев. Здесь мы представляем протокол заразить мышиных макрофаги костного мозга, полученных в культуре с лейшманий, следуют точную количественную оценку роста внутриклеточных кинетики. Этот метод полезен для изучения отдельных факторов, влияющих на взаимодействие хост возбудителя и лейшмании вирулентности.
Abstract
Жизненный цикл лейшманий, возбудителя лейшманиоз, попеременно Промастиготы и amastigote этапов внутри насекомого и позвоночных хозяев, соответственно. Хотя патогенные симптомы лейшманиоза может широко варьировать, от доброкачественных кожных высоко смертельным заболеванием висцеральных форм в зависимости от видов инфекционный, всех видов Leishmania находятся внутри узла макрофаги этапе позвоночных их жизненный цикл. Таким образом, лейшмании инфективности напрямую связана с его способность вторгнуться, выжить и воспроизвести в пределах parasitophorous вакуоли (PVs) внутри макрофагов. Таким образом оценки паразита возможность реплицировать внутриклеточно служит надежный метод для определения вирулентности. Изучение развития лейшманиоз, с использованием животных моделей является длительным, утомительно и часто трудно, особенно с разработаны патогенетически важные висцеральные формы. Здесь мы описываем методологии следовать внутриклеточных развитие лейшманий в костный мозг производные макрофагов (BMMs). Внутриклеточный паразит чисел определяются интервалом 24 ч для 72-96 h после инфицирования. Этот метод позволяет для надежного определения воздействия различных генетических факторов на лейшманий вирулентности. В качестве примера мы покажем, как исключить один аллель гена лейшмании митохондриальной железа транспортера (LMIT1) ухудшает способность мутантный штамм лейшмании amazonensis LMIT1/ΔLmit1 расти внутри BMMs, отражая резкое сокращение в вирулентности, по сравнению с одичал типа. Этот assay также позволяет точно контролировать экспериментальных условиях, которые могут управляться индивидуально для анализа влияния различных факторов (питательные вещества, реактивнооксигенных видов, и т.д.) на хост возбудитель взаимодействия. Таким образом соотвествующего исполнения и количественной оценки BMM инфекции исследования обеспечивают неинвазивный, быстрым, экономичным, безопасный и надежный альтернативу обычным животной модели исследования.
Introduction
Лейшманиоз ссылается на широкий спектр человеческих заболеваний, вызванных простейших паразитов видов рода Leishmania. В настоящее время примерно 12 миллионов человек инфицированы лейшмании во всем мире, и более чем 350 миллионов подвергаются риску. Патологии болезни зависит от видов Leishmania и принимающих факторов, и симптомы варьируются от безобидных самовосстановления поражениях кожи смертоносных visceralizing формы. Если untreated, Висцеральный лейшманиоз является фатальным, рейтинг только после малярии как смертоносных болезней человека, вызванного инфекцией с простейших паразитов1. Несмотря на широкие различия в патологии заболеваний и симптомов всех видов Leishmania имеют жизненный цикл digenic, чередуя Промастиготы и amastigote этапов внутри насекомых и позвоночных хозяев, соответственно. Внутри позвоночных, лейшмании целевой хост макрофагов для вторжения и вызвать образование parasitophorous вакуоли (PVs), кислой отсеков с свойства фаголизосомах скопирована Высоко вирулентным amastigote формы. Amastigotes сохраняется в тканях хост во время хронической инфекции и может быть передан на неинфицированных москитов, завершая цикл передачи. Таким образом в контексте развития болезней человека, amastigotes являются наиболее важным лейшмании жизненного цикла формы2. Расследование, как amastigotes репликацию внутри макрофагов PVs имеет решающее значение для понимания лейшмании вирулентности3,4,5,6,7 и для Разработка новых эффективных терапии.
Здесь мы описываем метод регулярно используется в нашей лаборатории для изучения лейшмании инфекции и репликации в костный мозг производные макрофагов (BMMs), который включает количественную оценку числа внутриклеточных лейшмании со временем. Этот процесс включает сбор моноциты из костного мозга мыши и дифференцировку макрофагов в культуре, в vitro инфекцию с инфекционный формы (metacyclic promastigotes или amastigotes) Leishmania и количественной оценки количество внутриклеточных паразитов в каждом интервале 24 ч в течение 72-96 ч после инфицирования. В нашей лаборатории был использован этот assay для определения влияния нескольких экологических факторов и паразита генов, включая определение критической роли железа в содействии вирулентности L. amazonensis , который был также подтвержден зверолов исследований развития поражения в мышей6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Поскольку все патогенных видов Leishmania установить их репликативной нишу внутри узла макрофагов, этот assay может использоваться универсально для вирулентности определений всех видов Leishmania .
Выполнение BMM инфекций позволяет анализ основ паразито хозяинных взаимодействия на уровне отдельной ячейки и таким образом более широкое понимание как лейшмании паразитов взаимодействуют с их предпочтительным разместить микроокружения, PVs макрофагов. Макрофагов инфекцией assays успешно использовались несколько групп16,17,18,19,20,,2122 для изучения функции принимающей макрофагов и лейшмании специфических генов и их возможного участия в сложное взаимодействие, которое характеризует внутриклеточную инфекцию. БММ инфекции позволяют квантификации роста паразита как считывание влияния принимающей факторов, которые влияют внутриклеточных выживания, как производство оксида азота бактерицидных, генерации активных форм кислорода и других неблагоприятных условий с которыми внутри Лизосома как PVs23. Макрофагов инфекции анализов также были использованы для выявления потенциальных наркотиков приводит анти leishmanial для терапевтических развития13,24.
В vitro характер BMM инфекций обеспечивает несколько преимуществ перед другими методами для оценки лейшмании вирулентности. Однако несколько предыдущих исследований, изучения механизмов выживания внутриклеточный паразит со временем не количественно инфекции как ставка20,21,24. Кроме того многие исследования сосредоточены на после инфекции в естественных условиях со временем сделал это путем измерения размера кожные поражения и другие физиологические симптомы, которые лишь косвенно связаны с паразитом репликации25,26 , 27. в естественных условиях инфекции является строгий подход к оценке вирулентности возбудителя, но поражения размер измерения на основе зверолов, опухоль в одиночку часто являются неадекватными, поскольку они отражают воспалительной реакции в инфицированных тканях и не абсолютное количество паразитов. По этой причине развитие поражения зверолов анализов должны сопровождаться количественная оценка нагрузки паразита в инфицированных тканях, процедура, которая требует продолжительного ограничения разрежения assays28. Кроме того в vivo исследования часто связаны, жертвуя несколько животных в различные моменты времени для извлечения тканей интерес6,,8,9,,10, 11 , 13. В отличие от этого, большое количество BMMs могут быть получены только одно животное, и эти клетки могут быть покрытие в условиях, которые позволяют оценку инфекции в различные моменты времени. Кроме того по сравнению с в vivo исследований, выполняя в vitro BMM инфекций позволяет больший контроль над экспериментальных условиях. Количественная оценка макрофаги быть инфицированы наряду с паразитами, сами позволяет точный контроль кратности инфекции (МВД) и условий, культуры. Точный контроль над этими факторами могут быть ключом в определении характеристики дискретных сотовой пути и в понимании их влияния на ход инфекции.
С учетом этих преимуществ, это несколько удивительно, что очень немногие группы изучения лейшмании вирулентности пока полной мере воспользовались количественной оценки внутриклеточных репликации в макрофагах. В этой статье мы обсудим распространенных ошибок, которые могут быть затрудняет более широкое использование этот assay и предоставляют пошаговые протокол для облегчения ее надлежащего осуществления. Учитывая ее точность и универсальность пробирного BMM инфекции, которую мы опишем здесь могут не только быть использованы для изучения взаимодействия хост патогена, влияющие на лейшманий вирулентности, но и для изучения других микроорганизмов, которые реплицируют внутри макрофаги29. Важно отметить, что этот assay также могут быть разработаны как метод быстрый и экономичный доклинические скрининга для анти leishmanial разработки лекарственных препаратов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Количественные данные, подготовленные пробирного BMM инфекции, описанных выше, позволяет следователям получить показатели инфицирования и надежного определения изменения вирулентности свойств в относительно короткий период времени (максимум 2 недели, по сравнению с 2 месяцев, необход?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грант RO1 AI067979 NWA.
YK является получателем Бакалавриат стипендии от Говард Хьюз медицинский институт/Университет Мэриленд, Колледж Парк.
Materials
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
Riferimenti
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
- Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
- Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
- Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
- Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
- Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
- Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
- Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
- Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
- Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
- Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
- Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
- Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
- McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
- Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
- Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
- Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
- Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
- Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
- da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
- Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
- Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
- Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
- Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
- Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , 12 (2001).
- Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
- Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
- Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
- Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
- Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
- Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
- Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
- Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
- Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
- Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
- Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
- Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host’s autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
- Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
- Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
- Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
- McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
- Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
- Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
- Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
- Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
- Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).
