मैक्रोफेज के अंदर Intracellular विकास के ठहराव के डाह के आकलन के लिए एक तेज और विश्वसनीय विधि है Leishmania परजीवी
Summary
सभी रोगजनक Leishmania प्रजातियों में रहते है और उनके हड्डीवाला मेजबान के मैक्रोफेज अंदर दोहराने । यहां, हम Leishmaniaके साथ संस्कृति में murine अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज को संक्रमित करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद, intracellular वृद्धि कैनेटीक्स के सटीक ठहराव द्वारा पीछा किया । यह विधि होस्ट-रोगज़नक़ संपर्क और Leishmania डाह को प्रभावित करने वाले व्यक्तिगत कारकों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है ।
Abstract
Leishmaniaका जीवनचक्र, लीशमनियासिस का प्रेरणा का एजेंट, क्रमशः कीट और हड्डीवाला होस्ट्स के अंदर promastigote और amastigote चरणों के बीच वैकल्पिक । लीशमनियासिस के रोगजनक लक्षण व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं, सौम्य त्वचा के घावों से अत्यधिक घातक आंत रोग रूपों के लिए संक्रमित प्रजातियों के आधार पर, सभी Leishmania प्रजातियों के हड्डीवाला चरण के दौरान मेजबान मैक्रोफेज अंदर रहते हैं उनका जीवनचक्र । Leishmania infectivity इसलिए सीधे अपने आक्रमण, जीवित और PVs अंदर parasitophorous रिक्तिकाएं (मैक्रोफेज) के भीतर दोहराने की क्षमता से संबंधित है । इस प्रकार, को दोहराने intracellularly है परजीवी की क्षमता का आकलन डाह निर्धारित करने के लिए एक भरोसेमंद विधि के रूप में कार्य करता है । पशु मॉडलों का उपयोग कर लीशमनियासिस विकास का अध्ययन समय लेने वाली है, थकाऊ और अक्सर मुश्किल है, विशेष रूप से pathogenically महत्वपूर्ण आंत रूपों के साथ. हम यहां एक पद्धति का वर्णन करने के लिए अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMMs) में Leishmania के intracellular विकास का पालन करें । Intracellular परजीवी संख्या 72 के लिए 24 एच अंतराल पर निर्धारित कर रहे है-96 एच निंनलिखित संक्रमण । इस विधि में Leishmania डाह पर विभिंन आनुवंशिक कारकों के प्रभाव का एक विश्वसनीय दृढ़ संकल्प के लिए अनुमति देता है । एक उदाहरण के रूप में, हम बताते है कि कैसे Leishmania Mitochondrial आयरन ट्रांसपोर्टर जीन (LMIT1) के एक एकल एलील विलोपन Leishmania amazonensis उत्परिवर्ती तनाव LMIT1/ΔLmit1 की क्षमता बिगड़ती BMMs अंदर बढ़ने के लिए, जंगली प्रकार की तुलना में डाह में भारी कमी को दर्शाती है । यह परख भी प्रयोगात्मक शर्तों के सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है, जो व्यक्तिगत रूप से विभिंन कारकों के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है (पोषक तत्वों, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, आदि) मेजबान रोगज़नक़ बातचीत पर । इसलिए, उचित निष्पादन और ठहराव बीएमएम संक्रमण के अध्ययन के एक गैर इनवेसिव, तेजी से, किफायती, सुरक्षित और विश्वसनीय पारंपरिक पशु मॉडल अध्ययन के लिए विकल्प प्रदान करते हैं ।
Introduction
लीशमनियासिस जीनस Leishmaniaके प्रोटोजोआ परजीवी प्रजातियों की वजह से मानव रोगों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम को संदर्भित करता है । लगभग १२,०००,००० लोग वर्तमान में दुनिया भर में Leishmania से संक्रमित हैं, और ३५०,०००,००० से अधिक खतरे में हैं । रोग विकृति Leishmania प्रजातियों पर और मेजबान कारकों पर निर्भर करता है, और लक्षण अहानिकर आत्म चिकित्सा त्वचा घावों से घातक visceralizing रूपों के लिए बदलती हैं । अगर अनुपचारित, आंत लीशमनियासिस घातक है, केवल एक प्रोटोजोआ परजीवी के साथ संक्रमण की वजह से घातक मानव रोग के रूप में मलेरिया के बाद रैंकिंग1. रोग विकृति और लक्षणों में व्यापक मतभेद के बावजूद, सभी Leishmania प्रजातियों में एक digenic जीवन चक्र promastigote और amastigote के बीच बारी-साइकिल है कीट और हड्डीवाला मेजबान के अंदर चरणों, क्रमशः । रीढ़ के अंदर, Leishmania लक्ष्य मेजबान मैक्रोफेज आक्रमण के लिए और parasitophorous रिक्तिकाएं (PVs) के गठन के लिए प्रेरित, phagolysosomes के गुणों के साथ अंलीय डिब्बों जहां उच्च विषमय amastigote रूपों दोहराने । Amastigotes पुराने संक्रमण के दौरान मेजबान ऊतकों में जारी रहती है और संक्रमित sandflies को आगे पारित किया जा सकता है, संचरण चक्र को पूरा करने. इसलिए, मानव रोग विकास के संदर्भ में, amastigotes सबसे महत्वपूर्ण Leishmania जीवनचक्र प्रपत्र2हैं । जांच कैसे amastigotes मैक्रोफेज PVs अंदर दोहराने के लिए महत्वपूर्ण है Leishmania डाह समझ3,4,5,6,7 और के लिए उपन्यास प्रभावोत्पादक उपचारों का विकास ।
हम यहां एक नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला द्वारा उपयोग के लिए अस्थि मज्जा में Leishmania संक्रमण और प्रतिकृति अध्ययन-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMMs) है, जो समय के साथ intracellular Leishmania की संख्या का मात्रात्मक आकलन शामिल है एक विधि का वर्णन । प्रक्रिया माउस अस्थि मज्जा और मैक्रोफेज को संस्कृति में भेदभाव से monocytes की कटाई शामिल है, इन विट्रो में संक्रमण के साथ संक्रमित रूपों (metacyclic promastigotes या amastigotes) के Leishmania और ठहराव के 72-96 एच निम्नलिखित संक्रमण की अवधि के लिए हर 24 एच अंतराल पर intracellular परजीवी की संख्या । यह परख हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया गया है कई पर्यावरणीय कारकों और परजीवी जीन के प्रभाव को निर्धारित करने में आयरन की महत्वपूर्ण भूमिका की पहचान सहित एल amazonensis डाह कि आगे footpad द्वारा मांय किया गया था चूहों में घाव विकास अध्ययन6,8,9,10,11,12,13,14,15 . के बाद से सभी रोगजनक Leishmania प्रजातियों मेजबान मैक्रोफेज के अंदर अपने प्रतिकृति आला स्थापित, इस परख सार्वभौमिक सभी Leishmania प्रजातियों में डाह निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
बीएमएम संक्रमण प्रदर्शन एक सेल स्तर पर मेजबान-परजीवी बातचीत के विश्लेषण की अनुमति देता है, और इस प्रकार कैसे Leishmania परजीवी अपने पसंदीदा मेजबान microenvironment, मैक्रोफेज के PVs के साथ बातचीत की एक और अधिक व्यापक समझ । मैक्रोफेज संक्रमण परख सफलतापूर्वक कई समूहों द्वारा इस्तेमाल किया गया है16,17,18,19,20,21,22 का पता लगाने के लिए दोनों मेजबान मैक्रोफेज और Leishmania विशिष्ट जीन के कार्य, और उनके जटिल खेल है कि intracellular संक्रमण की विशेषता में संभावित भागीदारी । बीएमएम संक्रमण intracellular अस्तित्व, microbicidal नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और अन्य प्रतिकूल परिस्थितियों की पीढ़ी के रूप में प्रभावित है कि मेजबान कारकों के प्रभाव के एक पढ़ें-बाहर के रूप में परजीवी विकास की अनुमति ठहराव lysosome के अंदर पडा-जैसे PVs23। मैक्रोफेज संक्रमण परख भी क्षमता विरोधी leishmanial दवा की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया है चिकित्सीय विकास13,24के लिए सुराग ।
बीएमएम संक्रमण के इन विट्रो प्रकृति Leishmania डाह का आकलन करने के लिए अन्य तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है । हालांकि, कई पिछले समय के साथ intracellular परजीवी अस्तित्व के तंत्र की जांच अध्ययन एक दर20,21,24के रूप में संक्रमण नहीं है । इसके अलावा, कई समय के साथ vivo संक्रमण में निंनलिखित पर ध्यान केंद्रित अध्ययन त्वचा के घावों का आकार और अंय शारीरिक लक्षण है कि केवल परोक्ष रूप से परजीवी प्रतिकृति25,26 से संबंधित है मापने के द्वारा किया था , 27. vivo में संक्रमण परजीवी डाह का आकलन करने के लिए एक कड़े दृष्टिकोण है, लेकिन footpad सूजन के आधार पर घाव का आकार माप अक्सर अपर्याप्त हैं, के रूप में वे संक्रमित ऊतकों में भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित नहीं है और परजीवी की निरपेक्ष संख्या । इस कारण से, footpad घावों के विकास के लिए परख संक्रमित ऊतकों, एक प्रक्रिया है कि लंबे कमजोर पड़ने परख28सीमित की आवश्यकता होती है में परजीवी लोड के ठहराव द्वारा पीछा किया जाना है । इसके अतिरिक्त, vivo में अध्ययन अक्सर विभिंन बिंदुओं पर कई जानवरों का त्याग शामिल करने के लिए ब्याज की ऊतकों को निकालने के लिए समय में6,8,9,10, 11 , 13. इसके विपरीत, BMMs की बड़ी संख्या सिर्फ एक जानवर से प्राप्त की जा सकती है, और इन कोशिकाओं को शर्तों के तहत चढ़ाया जा सकता है जो समय में विभिन्न बिंदुओं पर संक्रमण के आकलन की अनुमति देते हैं । इसके अलावा, vivo अध्ययनों में की तुलना में, इन विट्रो बीएमएम संक्रमण में प्रदर्शन प्रयोगात्मक शर्तों पर अधिक से अधिक नियंत्रण की अनुमति देता है । मैक्रोफेज को बढ़ाता है परजीवी के साथ साथ संक्रमित होने के लिए खुद को संक्रमण की बहुलता (MOI) और संस्कृति की स्थिति का सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है । इन कारकों पर ठीक नियंत्रण असतत सेलुलर रास्ते की विशेषताओं की पहचान करने में और संक्रमण के पाठ्यक्रम पर उनके प्रभाव को समझने में महत्वपूर्ण हो सकता है ।
इन फायदों को देखते हुए यह कुछ हद तक आश्चर्य की बात है कि Leishmania डाह का अध्ययन बहुत कुछ समूहों अब तक मैक्रोफेज में intracellular प्रतिकृति के मात्रात्मक मूल्यांकन का पूरा लाभ लिया है । इस अनुच्छेद में, हम आम नुकसान है कि इस परख के अधिक व्यापक उपयोग में बाधा हो सकती है चर्चा, और एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए इसके समुचित कार्यांवयन की सुविधा । अपनी सटीक और बहुमुखी प्रतिभा को ध्यान में रखते हुए, बीएमएम संक्रमण परख हम यहां का वर्णन केवल मेजबान-रोगज़नक़ Leishmania डाह को प्रभावित करने वाली बातचीत का पता लगाने का उपयोग नहीं किया जा सकता है, लेकिन यह भी अंय सूक्ष्मजीवों कि अंदर दोहराने अध्ययन के लिए मैक्रोफेज29. महत्वपूर्ण बात यह है कि इस परख को एंटी leishmanial ड्रग डेवलपमेंट के लिए तीव्र और किफायती पूर्व नैदानिक जांच पद्धति के रूप में भी विकसित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
मात्रात्मक बीएमएम संक्रमण परख द्वारा उत्पादित डेटा ऊपर वर्णित है, जांचकर्ताओं संक्रमण की दर और एक अपेक्षाकृत कम समय अवधि में डाह गुण में परिवर्तन का एक विश्वसनीय दृढ़ संकल्प प्राप्त करने की अनुमति द?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान RO1 AI067979 द्वारा NWA को समर्थन दिया गया.
यूसुफ हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान से स्नातक फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है/मैरीलैंड कॉलेज पार्क के विश्वविद्यालय ।
Materials
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
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