Kvantifiering av intracellulära tillväxt inuti makrofager är en snabb och tillförlitlig metod för att bedöma virulens Leishmania parasiter
Summary
Alla patogena Leishmania arter uppehålla och replikera inuti makrofager av deras ryggradsdjur värdar. Här presenterar vi ett protokoll för att infektera murina benmärg-derived makrofager i kultur med Leishmania, följt av exakt kvantifiering av intracellulära tillväxt kinetik. Denna metod är användbar för att studera enskilda faktorer som påverkar värd-patogen interaktion och Leishmania virulens.
Abstract
Livscykeln för Leishmania, vilka smittämnen av leishmaniasis, växlar mellan promastigote och amastigote stadier inuti insekten och ryggradsdjur värdar, respektive. Medan patogena symtom av leishmaniasis kan variera kraftigt, från godartade kutana lesioner mycket dödlig visceral sjukdom former beroende på de smittbärande arterna, finnas alla Leishmania arter inuti värd makrofager under ryggradsdjur deras livscykel. Leishmania smittsamhet är därför direkt relaterad till dess förmåga att invadera, överleva och replikera inom parasitophorous vakuoler (PVs) inuti makrofager. Således fungerar att bedöma parasitens möjlighet att replikera intracellulärt som en pålitlig metod för att bestämma virulens. Att studera leishmaniasis utveckling med hjälp av djurmodeller är tidskrävande, tråkiga och ofta svårt, särskilt med pathogenically viktigt viscerala former. Här beskriver vi en metod för att följa intracellulära utvecklingen av Leishmania i benmärgen-derived makrofager (BMMs). Intracellulär parasit nummer bestäms vid 24 h intervall för 72-96 timmar efter infektion. Denna metod möjliggör en tillförlitlig bestämning av effekterna av olika genetiska faktorer på Leishmania virulens. Som ett exempel visar vi hur en enda allel borttagning av Leishmania mitokondriell järn transportör genen (LMIT1) försämrar den Leishmania amazonensis mutant stammen LMIT1/ΔLmit1 förmåga att växa inuti BMMs, återspeglar en drastisk minskning i virulens jämfört med vildtyp. Denna analys kan också exakt kontroll av experimentella betingelser, som individuellt kan manipuleras för att analysera påverkan av olika faktorer (näringsämnen, reaktiva syreradikaler, osv.) på värd-patogen interaktionen. Därför ger lämpligt genomförande och kvantifiering av BMM infektion studier en icke-invasiv, snabb, ekonomisk, säker och tillförlitlig alternativ till konventionella djurmodell studier.
Introduction
Leishmaniasis refererar till ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar orsakade av protozo parasitarter av släktet Leishmania. Cirka 12 miljoner människor är för närvarande infekterade med Leishmania världen över, och mer än 350 miljoner är i riskzonen. Sjukdom patologi beror på arterna som Leishmania och värd faktorer och symtom varierar från innocuous självläkande hudlesioner dödliga visceralizing former. Om obehandlat, visceral leishmaniasis är dödlig, förmånsrätt endast efter malaria som den dödligaste mänskliga sjukdomen orsakas av infektion med en protozo parasit1. Trots omfattande skillnaderna i sjukdom patologi och symtom har alla Leishmania arter en digenic livscykel alternerande mellan promastigote och amastigote stadier inuti insekter och ryggradsdjur värdar, respektive. Insidan ryggradsdjur, Leishmania target host makrofager för invasion och inducera bildandet av parasitophorous vakuoler (PVs), sura fack med egenskaperna hos phagolysosomes där de mycket virulent amastigote formerna replikera. Amastigotes kvarstår i värd vävnader under kroniska infektioner och kan föras framåt till oinfekterade sandflugor, slutföra överföringen cykeln. Därför, i samband med mänsklig sjukdomsutveckling, amastigotes är den viktigaste Leishmania lifecycle form2. Undersöka hur amastigotes replikera inuti makrofag PVs är kritisk för förståelse Leishmania virulens3,4,5,6,7 och för den utvecklingen av nya effektiva behandlingar.
Här beskriver vi en metod som används regelbundet av vårt laboratorium för att studera Leishmania -infektion och replikering i benmärgen-derived makrofager (BMMs), som innebär kvantitativ bedömning av numrera av intracellulära Leishmania över tid. Processen omfattar skörd av monocyter från mus benmärg och differentiering till makrofager i kultur, in vitro- infektion med infektiös former (metacyclic promastigotes eller amastigotes) av Leishmania och kvantifiering av de antal intracellulära parasiter på varje 24 h intervall under en 72-96 timmar efter infektion. Denna analys har använts i vårt laboratorium för att avgöra inverkan av flera miljöfaktorer och parasit gener, inklusive identifiering av järn kritiska roll att främja L. amazonensis virulens som ytterligare godkänts av footpad lesion utvecklingsstudier möss6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Eftersom alla patogena Leishmania arter etablera sin replikationsförmåga nisch inne värd makrofager, kan denna analys användas universellt för virulens bestämningar i alla Leishmania arter.
Utför BMM infektioner möjliggör analys av värd-parasit interaktioner på enstaka cellnivå, och därmed en mer omfattande förståelse för hur Leishmania parasiter interagerar med deras föredragna värden mikromiljö, PVs av makrofager. Makrofag infektion analyser har använts framgångsrikt av flera grupper16,17,18,19,20,21,22 att utforska funktioner i både värd makrofag Leishmania specifika gener och deras potentiella deltagande i det komplexa samspelet som kännetecknar intracellulära infektion. BMM infektioner möjliggöra kvantifiering av parasiten tillväxt som en avläsning av värd faktorer som påverka intracellulär överlevnad, såsom microbicidal kväveoxid produktion, generation av reaktiva syreradikaler och andra ogynnsamma effekter påträffade inuti den Lysosomen-liknande PVs23. Makrofag infektion analyser har också använts för att identifiera potentiella anti-leishmanial drug leads för terapeutisk utveckling13,24.
In vitro- beskaffenhet BMM infektioner ger flera fördelar jämfört med andra metoder för att bedöma Leishmania virulens. Flera tidigare studier att undersöka mekanismer för intracellulär parasit överlevnad över tid dock inte kvantifiera infektion som en kurs20,21,24. Dessutom gjorde många studier fokuserat på följande i vivo infektioner med tiden så genom att mäta kutan lesionsstorlek och andra fysiologiska symtom som endast indirekt avser parasit replikering25,26 , 27. in vivo -infektion är en stränga metod att bedöma parasit virulens, men lesionens storlek mätningar baserat på footpad svullnad ensam är ofta otillräckliga, eftersom de återspeglar den inflammatoriska reaktionen i infekterade vävnader och inte den absoluta antalet parasiter. Av denna anledning, footpad lesion utveckling analyser måste följas av kvantifiering av parasiten lasten i infekterade vävnader, analyser en procedur som kräver långa begränsande utspädning28. Dessutom, innebär in-vivo studier ofta att offra flera djur vid olika punkter i tiden för att extrahera vävnader av intresse6,8,9,10, 11 , 13. däremot stort antal BMMs kan erhållas från bara ett djur, och dessa celler kan beläggas under förhållanden som gör bedömningen av infektion på olika punkter i tiden. Dessutom tillåter utför in vitro- BMM infektioner jämfört med in-vivo studier, större kontroll över försöksbetingelser. Kvantifiera den makrofager att smittas tillsammans med parasiterna själva tillåter exakt kontroll av multiplicityen av infektion (MOI) och odlingsbetingelser. Fina kontroll över dessa faktorer kan vara avgörande att identifiera kännetecken för diskreta cellulära vägar och förstå deras inverkan på loppet av infektion.
Med tanke på dessa fördelar, är det något förvånande att mycket få grupper studerar Leishmania virulens hittills har tagit full nytta av kvantitativ bedömning av intracellulär replikering i makrofager. I den här artikeln diskuterar vi vanliga fallgropar som kan vara hämmar mer omfattande utnyttjande av denna analys, och tillhandahålla ett stegvisa protokoll för att underlätta genomförs korrekt. Med tanke på dess precision och mångsidighet, BMM infektion analysen beskriver vi här kan inte bara utnyttjas att utforska värd-patogen interaktioner påverkar Leishmania virulens, men också att studera andra mikroorganismer som replikerar inuti makrofager29. Viktigast av allt, kan denna analys också utvecklas som en snabb och ekonomisk prekliniska screeningmetod för anti-leishmanial läkemedelsutveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvantitativa data produceras av BMM infektion analysen beskrivs ovan, kan utredarna att få priser för infektion och en tillförlitlig bestämning av förändringar i virulens boenden i relativt kortare period (högst 2 veckor, jämfört med 2 månader som krävs för i vivo experiment). Denna metod förlitar sig på DNA specifika färgämnet DAPI, som specifikt fläckar makrofag och parasit kärnor, och tillåter snabb identifiering och kvantifiering av infekterade celler. I jämförelse binder andra fläckar …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av National Institutes of Health grant RO1 AI067979 till NWA.
YK är mottagaren av grundutbildning fellowship från Howard Hughes Medical Institute/universitetet i Maryland College Park.
Materials
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
Riferimenti
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
- Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
- Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
- Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
- Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
- Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
- Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
- Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
- Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
- Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
- Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
- Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
- Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
- McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
- Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
- Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
- Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
- Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
- Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
- da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
- Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
- Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
- Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
- Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
- Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , 12 (2001).
- Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
- Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
- Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
- Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
- Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
- Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
- Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
- Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
- Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
- Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
- Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
- Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host’s autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
- Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
- Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
- Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
- McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
- Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
- Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
- Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
- Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
- Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).
