Ecdysone المستندة إلى مستقبلات فريدة الجينات التبديل للتعبير المتعمد للتحوير مع المتانة وإمكانية الرجوع ويجتازها لا يعتد بها
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتحوير التحوير التعبير استخدام تبديل الجين المفرد pEUI(+) بالمعاملة تيبوفينوزيدي.
Abstract
من المستحسن مراقبة دقيقة للتعبير التحوير في الدراسات السريرية والبيولوجية. ومع ذلك، نظراً للميزة ثنائي لتبديل الجينات المستخدمة حاليا يتطلب نقل وحدتين التعبير العلاجية وفي نفس الوقت في خلية واحدة، يقتصر التطبيق العملي لنظام العلاج الجيني. لتبسيط نظام التعبير التحوير، أنشأنا تبديل جينات سميت pEUI(+) يضم مجموعة كاملة من وحدات التعبير التحوير في ناقل واحد. تتألف من المجال GAL4 الحمض النووي ملزم وتعديل لائحة المجلس الأوروبي (جفيكر)، مجال تنشيط VP16 الحد أدنى تنصهر مع مجال GAL4 الحمض النووي ملزم، فضلا عن مستقبل ecdysone المورفولوجية معدلة (EcR)، التبديل الجين المفرد المطورة حديثا الغاية تستجيب لإدارة محفز الكيميائية بطريقة تعتمد على وقت وجرعة. ناقل pEUI(+) أداة قوية لتحسين السيطرة على التعبير التحوير في البحوث البيولوجية والدراسات ما قبل السريرية. نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتحوير لتعبير التحوير عابرة ومستقرة باستخدام ناقلات pEUI(+) بمعاملة تيبوفينوزيدي (Teb). بالإضافة إلى ذلك، ونحن نشاطر مبادئ توجيهية هامة لاستخدام Teb كمحفز المواد كيميائية.
Introduction
تم استكشاف العديد من رموز تبديل الجينات المختلفة لقدرتها على تنظيم الذات التعبير التحوير في خلية ثقافة ونماذج حيوانية، بدرجات متفاوتة من النجاح1،،من23. نظم التبديل الجينات المحتملة ينبغي أن تجتمع عدة معايير صارمة، بما في ذلك: التعبير الاتجاه الدقيق للتحوير، وتعتمد على الجرعة ووقت الاستجابة للحمام، يجتازها ضئيلة من المروج، وإمكانية الرجوع للتحوير التنشيط عن طريق إزالة محفز، ومحفِّز السمية مستويات مقبولة لخطوط الخلايا ومختبر الحيوانات1،،من23. استغلوا مستحثات جزيء صغيرة عديدة، بما في ذلك تترسكلين4،5، ربمسن6،،من78، الميفيبريستون9،10، و ecdysone11،12،،من1314. بشكل عام، هذه الأنظمة تتطلب اثنين على الأقل البلازميدات المحتوية على وحدات التعبير منفصلة اثنين أو ثلاثة، وواحد أو اثنين من الذي يؤلف عنصر تنظيمي (محفز بلازميد) التي تربط محفز جزيء صغير لاكتساب النشاط الترانسكربتي؛ وآخر بلازميد (المستجيب بلازميد) التي تحتوي على التحوير تحت سيطرة منطقة الحمض النووي التنظيمية التي تسمح الوصول لعنصر تنظيمي محفز زمنياً. ويعتبر العيب الرئيسي للنظام الثنائي أنه يتطلب إدخال ما يصاحب ذلك من موجهات اثنين (محفز والمستجيب) في الخلية الهدف. في تجارب التعبير التحوير عابرة، تنتج تعداء المتزامن لاثنين والبلازميدات حتما عدد أن خلايا منفردة transfected مع محفز أو المستجيب، أو شارك transfected غير متكافئ. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب نظام ثنائي على الأقل جولتين من اختيار المضادات الحيوية لإنشاء خطوط الخلايا مستقرة، وشاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. وهكذا، الجمع بين جميع العناصر المطلوبة للتحوير التعبير والتنظيم إلى ناقل واحد سيكون أمرا مثاليا لضمان التعبير الملازمة لجميع العناصر المطلوبة في خلية واحدة وتسمح لتنظيم التعبير التحوير من خلال المعاملة مع مستحثات جزيء صغير.
للتغلب على أوجه قصور تبديل ثنائي الجينات، نحن مؤخرا بوضع رمز تبديل جين المفرد، استخدام melanogaster المورفولوجية الجينات على أساس لائحة المجلس الأوروبي نظام إيندوسيبلي15. اكديسوني يتوسط التعبير الجيني عند ذلك بربط هيتيروديمير EcR/أولتراسبيراكلي (جامعة جنوب المحيط الهادئ)، مما يدفع بدوره ملزم من لائحة المجلس الأوروبي للحمض النووي العناصر التنظيمية3،11. مستقبلات ريتينويد الفقاريات X (ركسر)، أورثولوج الحشرات جامعة جنوب المحيط الهادئ، المجندين EcR النموذج نشط منشط النسخي16. وهكذا، للتعبير المستهدفة من التحوير في خلايا الفقاريات أو الأنسجة، لائحة المجلس الأوروبي ركسر يجب أن يكون والمشترك أعرب في نفس الوقت قبل أن تحفزها ecdysone أو أن يضع. نظراً لميزة هيتيروديميريك للتبديل الجينات على أساس لائحة المجلس الأوروبي يمكن أن يتأثر بالذاتية ركسر المستوى، باديدام وآخرون. الاستعاضة عن المجالات EcR الحمض النووي ملزم والتنشيط مع مغايرة GAL4 الحمض النووي ملزم، vmw65 بروتين فيروس الحلأ البسيط تنصهر فيها مجالات التنشيط (VP16) إلى المجال ملزم يجند لائحة المجلس الأوروبي، ثم أصبح لا يستجيب ركسر الذاتية وشكلت هوموديمير للحصول على نشاط النسخي17. تبديل الجين على أساس لائحة المجلس الأوروبي كذلك تحسنت بتشييد بروتين تشيميريك تتألف من أدنى مجال التنشيط VP16 جنبا إلى جنب مع جفيكر، التي شكلت هوموديمير وفي سيتوسول في غياب مؤثر اكديسوني،، Teb16مترجمة 18. بالربط إلى Teb, تغير جفيكر تعريب سوبسيلولار من سيتوسول إلى نواة الاعتراف بمروج مختلطة المؤلفة من الزرد E1b المروج الحد الأدنى جنبا إلى جنب مع عشرة جنبا إلى جنب تكرار تسلسلات التنشيط المنبع (أواس) الشروع في النسخ من الجينات الهدف16.
لتبسيط الجينات على أساس لائحة المجلس الأوروبي سبق الإبلاغ عنها تبديل16،18، نحن دمج ميزات النظام الثنائي في ناقل واحد مجهزة بجميع العناصر المطلوبة لحفز التحوير التعبير ومن ثم عينت الموجه الذي تم إنشاؤه حديثا، pEUI(+) (رقم الانضمام إلى بنك الجينات: KP123436، الشكل 1A)15. المستجيب الاستجابة إلى برنامج تشغيل جفيكر (يشار إليها فيما بعد سائق) يتكون من عشر جنبا إلى جنب UAS يكرر بجوار مروج الحد أدنى E1b يليه موقع الاستنساخ لأغراض متعددة (MCS) اكوري، بملي، ني، بمتى، افتتاح، وأفليي من الاعتراف بتسلسل (الشكل 1B). بالإضافة إلى ذلك، لتسهيل الاختيار transfected الخلايا، بوروميسين يحركها مروج SV40 ن-أسيتيل-جين ترانسفيراز (PAC) وضعت بين منطقتي السائق والمستجيب للحفاظ على خطوط خلايا مستقرة (الشكل 1).
يمكننا وصف بروتوكول مفصل لتحوير التحوير التعبير باستخدام pEUI(+) عابرة ومستقرة. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم إرشادات مفصلة عن الاستخدام الناجح ل Teb كمؤثر اكديسوني.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويعتبر العيب الرئيسي لاستخدام مفتاح تبديل تعبير جينات ثنائي هو الحاجة إلى توصيل والبلازميدات منفصلة اثنين (سائق والمستجيب) في نفس الوقت إلى الخلية الهدف. وهذا يمكن أن يؤدي إلى توزيع غير متكافئ والبلازميدات والنتيجة في استجابة غير متناسقة للتبديل إلى الحمام1،،من<s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون “تشوي” S-Y (الجامعة الوطنية أكثر) لقراءة دقيقة لدينا المخطوط والتعليقات القيمة. وأيد هذا العمل إنشاء صندوق بحوث لجامعة تشونجنام الوطنية.
Materials
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
Riferimenti
- Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).
- Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).
- Suzuki, Y., Suzuki, Y., Xu, K. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. , 285-309 (2011).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
- Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).
- Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
- Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).
- Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).
- Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).
- Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).
- Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).
- Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).
- Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).
- Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).
- Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).
- Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N’-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).
- Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).
- Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).
- McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).
- Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).
- Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
- Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).
- Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).
