Un ecdisona basada en Receptor Singular gen interruptor para deliberada expresión del transgén con robustez, reversibilidad y filtración insignificante
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la modulación de la expresión transgénica mediante interruptor gen singular de pEUI(+) tratamiento de tebufenozide.
Abstract
Control preciso de la expresión del transgén es deseable en estudios biológicos y clínicos. Sin embargo, debido a la función binaria de interruptores Gen actualmente empleada requiere a la transferencia de dos unidades de expresión terapéutica al mismo tiempo en una sola celda, la aplicación práctica del sistema de terapia génica es limitada. Para simplificar el sistema de expresión del transgen, hemos generado un interruptor gen designado como pEUI(+) que abarca un conjunto completo de módulos de expresión del transgen en un solo vector. Que comprende el dominio de unión al ADN de GAL4 y modificado EcR (GvEcR), un mínimo dominio de activación VP16 fusionado con un dominio de unión al ADN de GAL4, así como un receptor de ecdisona Drosophila modificado (EcR), el interruptor nuevo gene singular es altamente respuesta a la administración de un inductor químico en una forma dependiente de dosis y tiempo. El vector de pEUI(+) es una herramienta potencialmente poderosa para mejorar el control de la expresión del transgen en investigación biológica y estudios pre-clínicos. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la modulación de una expresión transitoria y estable del transgén pEUI(+) vector mediante el tratamiento de tebufenozide (Teb). Además, compartimos importantes directrices para el uso de Teb como un inductor químico.
Introduction
Varios genes diferentes interruptores han sido explorados por su capacidad para regular precisamente expresión de transgenes en los cultivos celulares y modelos animales, con diversos grados de éxito1,2,3. Sistemas de interruptor de genes potenciales deben cumplir varios criterios estrictos, incluyendo: precisa expresión direccional del transgen, capacidad de respuesta de dosis y tiempo dependiente inductores, insignificante filtración del promotor, reversibilidad del transgén activación a través de la eliminación del inductor, inductor de la toxicidad niveles y tolerable para líneas celulares y animales de laboratorio1,2,3. Han explotado varios inductores de molécula pequeña, como tetraciclina4,5, rapamicina6,7,8, mifepristona9,10, y ecdisona11,12,13,14. En general, estos sistemas requieren al menos dos plásmidos que contienen dos o tres unidades de expresión discreta, uno o dos de los cuales componen un elemento regulador (plásmido inductor) que se une un inductor de molécula pequeña para obtener actividad transcripcional; y otro plásmido (plásmido efectoras) que contiene el transgén bajo el control de una región reguladora de ADN que permite el acceso del elemento inductor-limite reglamentario. El principal inconveniente del sistema binario es que requiere la introducción concomitante de dos vectores (inductor y efectoras) en la célula diana. En experimentos de expresión transitoria del transgén, la transfección simultánea de dos plásmidos inevitablemente produce una población de células individualmente transfectadas con el inductor o generador de efectos, o co transfected desigual. Además, el sistema binario requiere al menos dos rondas de selección antibiótica para establecer líneas celulares estables, que es lento y laborioso. Así, combinando todos los componentes necesarios para la expresión del transgen y regulación en un único vector sería lo ideal para garantizar la expresión concomitante de todos los elementos necesarios en una sola célula y permiten la regulación de la expresión del transgén mediante el tratamiento con inductores de molécula pequeña.
Para superar las deficiencias de los interruptores binarios gen, recientemente desarrollamos un interruptor gen singular, utilizando a Drosophila melanogaster de sistema inducible gene basadas en REC. p.15. Ecdisona media expresión génica cuando se une al heterodímero REC/ultraspiracle (USP), que a su vez induce la Unión de la EcR a ADN elementos reguladores3,11. El receptor de vertebrados retinoide X (RXR), un ortólogo de insecto USP, recluta a REC para formar un activador transcripcional activa16. Así, para la expresión específica de un transgén en las células de vertebrados o tejido, el EcR y RXR deben ser co expresado simultáneamente antes de ser estimulado por la ecdisona o sus agonistas. Puesto que la característica heterodiméricos del interruptor gen REC-basado puede ser influenciada por el endógeno RXR nivel, Padidam et al. reemplazado los dominios Rec. p. ADN y activación con heteróloga GAL4 DNA-que atan, Vmw65 del proteína del virus del herpes simple (VP16) dominios de activación fusionada en el dominio ligand-obligatorio de EcR, que luego se convirtió en insensible a RXR endógeno y formados de un homodímero para obtener actividad transcripcional17. El interruptor de genes basados en EcR fue mejorado mediante la construcción de una proteína quimérica de un mínimo dominio de activación VP16 combinado con GvEcR, que forma un homodímero y localizada en el citosol en ausencia de los agonistas de la ecdisona, Teb16, 18. Atando a Teb, la GvEcR cambió su localización subcelular desde el citosol al núcleo para reconocer un promotor híbrido de pez cebra E1b promotor mínimo combinado con un tándem diez repite secuencias de activación ascendente (UASs) para iniciar la transcripción del gen objetivo16.
Para simplificar el gen previamente divulgado basados en EcR interruptores16,18, combinamos las características binarias del sistema en un solo vector equipado con todos los elementos necesarios para la expresión de transgenes estimulante y luego designado el vector recién generado, pEUI(+) (número de GenBank: KP123436, figura 1A)15. El efector respondiendo al conductor GvEcR (en adelante el conductor) está formada por diez tándem UAS repite junto a un promotor mínimo de E1b, seguido por un sitio múltiple de clonado (MCS) con EcoRI PmlI, NheI, Piling, AfeI y AflII secuencias de reconocimiento (figura 1B). Además facilitar la selección de transfected las células, un puromicina impulsado por el promotor SV40 N-acetil-gen de la transferasa (PAC) se colocó entre las regiones controlador y generador de efectos para mantener líneas de células estables (figura 1).
Se describe un protocolo detallado para la modulación transitoria y estable de la expresión del transgen mediante pEUI(+). Además, proporcionamos instrucciones detalladas para el uso exitoso de Teb como un agonista de la ecdisona.
Protocol
Representative Results
Discussion
El principal inconveniente de la utilización de un interruptor de expresión del gen binario es la necesidad de ofrecer simultáneamente dos plásmidos separados (controlador y generador de efectos) en la célula diana. Esto puede conducir a una distribución desigual de plásmidos y resultar en una respuesta incoherente del interruptor para los inductores1,2,3. Otra deficiencia del sistema de dos vectores es que un mínimo de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen S Y Choi (Universidad Nacional de Chonnam) valiosos comentarios y la lectura cuidadosa de nuestro manuscrito. Este trabajo fue financiado por un fondo de investigación de la Universidad Nacional de Chungnam.
Materials
| pEUI(+) | TransLab | The patent license was transferred to TransLab Inc. | |
| Gene-Fect Transfection Reagent | TransLab | TLC-001 | |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Tebufenozide | Fluka | 31652 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| Puromycin | Corning | 58-58-2 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Welgene | LS015-01 | |
| DMEM | Welgene | LM001-05 | |
| Fetal Bovine Serum | Welgene | S001-01 | |
| Cell culture dish | SPL life science | 11090 | |
| mouse FLAG M2 | Sigma | F3165 | |
| anti-alpha tubulin antibody | Calbiochem | CP06 | |
| Cloning cylinder | Sigma | CLS31668 | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410.1 | |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent |
Thermo Fisher | 78505 | |
| 100X Protease inhibitor Cock. III | T&I | BPI-9200 |
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