Summary
I denne artikel beskrives en detaljeret metode for tilfældig mutagenese af et target gen i fission gær. Som et eksempel målrette vi rpt4 +, som koder en underenhed af 19S proteasom og screene for mutationer, at destabilisere heterochromatin.
Abstract
Tilfældig mutagenese af et gen, målet er almindeligt anvendt til at identificere mutationer, der giver den ønskede fænotype. Af de metoder, der kan bruges til at opnå tilfældig mutagenese, fejlbehæftet PCR er en praktisk og effektiv strategi til at generere en forskelligartet gruppe af mutanter (dvs., en mutant bibliotek). Fejlbehæftede PCR er den foretrukne metode, når en forsker søger at mutere en pre-definerede region, som regionen kodning af et gen, mens upåvirket andre genomisk regioner. Når biblioteket mutant forstærkes af fejlbehæftede PCR, skal det blive klonet i en egnet plasmid. Størrelsen af biblioteket genereret af fejlbehæftede PCR er begrænset af effektiviteten af trinnet kloning. I fission gær, Schizosaccharomyces pombe, kan trinnet kloning udskiftes ved hjælp af en yderst effektiv one-step fusion PCR til at generere konstruktioner til transformation. Mutanter af ønskede fænotyper kan derefter vælges ved hjælp af passende journalister. Her beskriver vi denne strategi i detaljer, tager som et eksempel, en reporter indsat på centromeric heterochromatin.
Introduction
Fremad genetik er et klassisk metode hvor forskere søger naturligt forekommende mutanter, der viser en særlig fænotype, og udføre genetiske analyser. I reverse genetik, mutationer er indført i et gen af interesse og fænotype er undersøgt. I sidstnævnte tilfælde bruges tilfældig mutagenese af et target gen ofte til at generere en pulje af mutanter, som efterfølgende vælges til ønskede fænotyper, såsom temperatur følsomhed eller ændret enzymatisk aktivitet. Forskellige metoder kan bruges til at opnå tilfældig mutagenese, herunder fejlbehæftet PCR1; UV bestråling2; kemiske mutagener, såsom ethyl methanesulfonate (EMS) eller salpetersyrling3; brugen af midlertidige mutator stammer, som dem over at udtrykke mutD5 4; og DNA blander5.
Her, beskriver vi en reverse-genetik strategi, hvor vi udnytter fejlbehæftet PCR for at generere mutant pools for et mål gen i fission gær. Som man kunne gætte fra navnet, genererer denne metode mutationer ved bevidst at indføre fejl under PCR. I modsætning til andre metoder til mutagenese tillader fejlbehæftet PCR bruger hen til definere regionen til at være mutagenized. Dette gør det særligt nyttig i bestræbelserne på at studere funktionen af en protein/domæne af interesse.
For at demonstrere denne tilfældig mutagenese procedure, bruger vi heri rpt4 +, som koder 19S proteasom subunit, som et eksempel. Rpt4 har vist sig at have proteolyse-uafhængig funktioner i organismer end fission gær6,7,8,9, og en defekt i proteolyse kunne forårsage indirekte effekter ved at ændre proteiner niveauer. Vi er derfor, screenes for mutanter, der udløste proteolyse-uafhængig ændringer, med mål at undersøge funktionen af proteasom på heterochromatin.
Fejlbehæftede PCR kan anvendes til nogen gene region ved tuning den placering, hvor primere binde. Mutanter, som udviser den ønskede fænotypiske forandringer kan identificeres med passende journalister. Her, vi udnyttet en ade6 + reporter indsat på centromer 1 ydre Gentag (otr) region10. Konstituerende heterochromatin er dannet på denne region11, så ade6 + reporter er tavshed i wild-type betingelse; Det angives ved røde kolonier10. En mutation, der destabiliserer det konstituerende heterochromatin på centromer vil føre til ekspression af ade6 + -reporter, der er visualiseret som hvide kolonier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af medier
- Forberede gær Extract med kosttilskud (ja), ja uden adenin (ja lav Ade), Pombe Glutamate medium (PMG12) og PMG uden adenin (PMG-Ade) ved at blande komponenterne som beskrevet i tabel 1. Ja-Ade (lav Ade) og PMG-Ade plader har alle de samme komponenter, men adenin udelades fra sidstnævnte.
- Brug de følgende salt (50 x) bestand: 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl, 2 g/L Na2så4 i destilleret vand. Filter sterilisere ved hjælp af et 0,22 µm porestørrelse filter og opbevares ved 4 ° C.
- Brug de følgende vitamin (1, 000 x) bestand: 1 g/L pantothenat, 10 g/L nikotinsyre, 10 g/L inositol, 10 mg/L biotin i destilleret vand. Filter sterilisere ved hjælp af et 0,22 µm porestørrelse filter og opbevares ved 4 ° C.
- Brug de følgende mineral (10, 000 x) bestand: 5 g/L borsyre, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1 g/L KI, 0,4 g/L CuSO4·5H2O , 10 g/L citronsyre i destilleret vand. Filter sterilisere ved hjælp af et 0,22 µm porestørrelse filter og opbevares ved 4 ° C.
Bemærk: Ja flydende medium kan gøres ved at udelade agaren.
- Autoklave medium og afkøles det til nedenstående 60 ° C under omrøring med en røre bar, med en sats på 200 rpm.
- For ja + G418 (geneticin) plader, skal du tilføje 1 mL/L G418 stamopløsning til Ja medium.
- Brug de følgende G418 (1, 000 x) bestand: 100 mg/mL G418 i destilleret vand. Filter sterilisere ved hjælp af et 0,22 µm porestørrelse filter, alikvot 1,5 mL centrifugeglas, og butikken ved-20 ° C.
- Rør til en anden 5-10 min og alikvot medierne i 90-mm petriskåle (1 L af medium delprøver til ca 40 petriskåle. Gemme plader ved 4 ° C.
2. kloning af rpt4 + og dets 5' / 3' UTRs
- Udføre PCR primere p1 og p2 (figur 1A) ved hjælp af fission gær genomisk DNA (gDNA) som skabelon i en samlet maengde paa 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x reaktion buffer), og anvende reaktion cyklusser beskrevet i tabel 2 til at forstærke en 3,315-base par (bp) fragment bestående af rpt4 + og dets 5' / 3' UTRs. Rense PCR produkt ved hjælp af en rensning kit13 , som anvist af fabrikanten (figur 1A).
- Fordøje pBlueScript KS(-) vektor14 og amplificerede DNA fragmentet indeholdende EUR rpt4 + med dens 5' / 3' UTRs med BamH1 og Xho1 i en samlet maengde paa 20 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x fordøjelsen buffer) ved 37 ° C i et vandbad til 16-18 h (figur 1B).
- Gel rense den fordøjede vektor (1,2% agarosegel) og DNA indsætte ved at udføre TAE-baserede Agarosen gelelektroforese (100 V, 1 h), udtagelse DNA bands i de ønskede størrelser og isolere DNA med en gel udvinding kit15.
- Ligate vektor og DNA Indsæt ved hjælp af T4 DNA ligase ved at udføre en 20-µL ligatur reaktion indeholdende 50-100 ng af vektor DNA, en ~ 3-fold kindtand overskydende Indsæt DNA, 400 U T4 DNA ligase, og 1 x ligatur buffer. Inkuber denne blanding på 18 ° C i 16-18 h.
- Omdanne den sammenskrevne DNA i 100 µL af E. coli DH5α ved at anvende varme chok for 70 s på 42 ° C. Der tilsættes 1 mL af LB og Inkuber i 1 time ved 37 ° C i opsving. Udføre centrifugering (13,800 x g), kassér supernatanten, pladen alle de transformerede E. coli celler på LB-Ampicillin (LA) plader og inkuberes ved 37 ° C i 16 h.
- Vælge 4-8 kolonier med tandstikkere og vokse natten over ved 37 ° C i 3 mL LA medium.
- Isolere plasmider med et plasmid rensning kit16 anvendes efter producentens protokol og udføre analytiske begrænsning enzym digestions med 5 µL af den isolerede plasmid, 5 U i hver begrænsning enzym (BamH1 og Xho1) og 1 x begrænsning buffer. Inkuber reaktionsblanding ved 37 ° C i et vandbad til 3 h. Bekræft kloning af sekventering kandidat plasmider.
3. indførelse af tavs Mutation (Xho1 begrænsning websted)
- Designe et par 33-bp-primere (p3 og p4), der indeholder den ønskede mutation i den ellers supplerende sekvens.
- Udføre PCR med Hi-Fi-polymerase17 (figur 1 c) i en samlet maengde paa 25 µL (10 ng af klonede plasmid, 2 µL af 10 pmol primer mix, 2 U enzym, 1 x reaktion buffer) ved hjælp af cykling parametrene listet i tabel 3.
- Fordøje skabelon plasmid med Dpnjeg i en samlet maengde paa 20 µL (20 U enzym, 1 x fordøjelsen buffer) ved 37 ° C i et vand bad for 1 h.
- Omdanne, udbrede, isolere og sekvens plasmid som indeholder den tavs mutation, som beskrevet i trin 2,5-2,7.
Bemærk: Tavs mutation kan også blive indført ved en kloning metode, som giver mulighed for sammenføjning af flere DNA-fragmenter i en fælles reaktion18.
4. tilfældig mutagenese af rpt4 + af fejlbehæftede PCR
- Udføre fejlbehæftet PCR, ved hjælp af plasmidet med den tavs mutation (Xho1 hjemmeside) som skabelonen, primere p5 og p6, en samlet maengde paa 50 µL (mængden af skabelonen defineret i trin 4.1.1, 2 µL af 10 pmol primer mix, 2,5 U enzym, 1 x reaktion buffer) , og en særlig polymerase, der er designet til at generere en høj fejl Vurder19 (figur 1 d). Udføre PCR, som beskrevet i tabel 2.
- Brug 4-5 µg af skabelon plasmid for at styre mutation frekvensen til 1 bp/kb (kilobase).
Bemærk: En høj koncentration (> 500 ng/µL) af plasmidet, som kan opnås ved hjælp af en mini prep kit20, er påkrævet.
- Brug 4-5 µg af skabelon plasmid for at styre mutation frekvensen til 1 bp/kb (kilobase).
- Bruge gelelektroforese for at bekræfte en PCR produkt af 2670 bp (1,2% agarosegel). Gel rense denne PCR produktet som beskrevet i trin 2,5.
5. forberedelse af Fusion PCR fragmenter (KAN, 3' UTR)
- Udføre PCR ved hjælp af pFA6a-KANMX621 som skabelon, primere p7 og p8, og betingelserne der er anført i tabel 4 at opnå markør (KAN) fragment. Gel rense den resulterende 1,480-bp fragment som beskrevet i trin 2,5 (figur 1E).
- Kontrollere hvis stop-codon af genet målrettet for mutation og dens tilstødende genet kodende region er adskilt af mere end 500 bp. Den endogene terminator kan ikke bruges, når denne er mindre end 500 bp; ADH terminator bør snarere bruges i stedet for den endogene terminator. Protokollen ændringer skal bruge ADH terminator er præsenteret i tabel 5.
Bemærk: Disse ændringer gælder kun når ADH terminator, som er tilgængelige i pFA6a-3HA-KANMX6 plasmid, bruges i stedet for den endogene terminator.
- Kontrollere hvis stop-codon af genet målrettet for mutation og dens tilstødende genet kodende region er adskilt af mere end 500 bp. Den endogene terminator kan ikke bruges, når denne er mindre end 500 bp; ADH terminator bør snarere bruges i stedet for den endogene terminator. Protokollen ændringer skal bruge ADH terminator er præsenteret i tabel 5.
- Udføre PCR med de klonede rpt4 +-indeholdende vektor som skabelon og primere p9 og p10 i en samlet maengde paa 50 µL (20 ng af de klonede plasmid, 2 µL af 10 pmol primer mix, 2 U enzym, 1 x reaktion buffer), ved hjælp af de betingelser, der er præsenteret i tabel 6. Gel rense den opnåede 506-bp 3' UTR fragment (figur 1E).
6. generation af Transformation konstruktionen af Fusion PCR (figur 1E)
- Forbered 3 fragmenter (mutagenized rpt4 +, KAN, og 3' UTR) på 50 ng/µL.
- Udføre fusion PCR af tre fragmenter ved hjælp af primere p11 og p12, som beskrevet i tabel 7. (Protokol for fusion PCR er en ændring af den oprindelige protokol22.) Rense den store 4,398-bp PCR produkt.
- Brug rpt4 +: KAN:3'UTR fragmenter i forholdet 1:3:1 for optimale resultater.
Bemærk: Indsæt DNA samlede bør ikke overstige 500 ng. Den anbefalede mængde af rpt4 +: KAN:3'UTR er 50 ng:150 ng:50 ng. Regionen mutagenized er ca. 1,6 kb, så det mindste antal gær kolonier, der ville tegne sig for alle mulige kombinationer af hvert base er muteret til tre andre er 1.600 x 3 = 4.800 kolonier. Fordi én transformation reaktion giver typisk 400-500 kolonier, kræves mindst 10 reaktioner værd af fusion PCR konstruere. Dette behov kan opfyldes ved blot at øge beløbet reaktion (dvs. antallet af PCR rør) med en faktor ti.
- Brug rpt4 +: KAN:3'UTR fragmenter i forholdet 1:3:1 for optimale resultater.
7. omdannelse af Fission gær af elektroporation (figur 1F)
- Podes gær til 10 mL af ja medium til mætning af inkubere det for mere end 16 h.
- Fortynd celler til en optisk tæthed på 600 nm (OD600) 0,2 i 200 ml af ja medium og inkuberes ved 30 ° C under omrystning for 5-6 h, til OD600 = 0,6 - 0,8.
- Koncentrere celler til OD600 = 30, dispensere til fire 50 mL koniske rør og chill i isbad i 10 min.
- Høste cellerne ved at udføre centrifugering ved 1050 x g i 3 min. ved 4 ° C. Sted rør og 10 electro-kuvetter på is. Udfør trin 7,3-7,8 på is.
- Supernatanten fjernes og der tilsættes 15 mL af 1,2 M sorbitol. Ryst forsigtigt rør for at resuspend cellerne.
- Centrifugeres celler ved 1050 x g i 3 min. ved 4 ° C.
- Gentag trin 7.4 og 7.5. Supernatanten. Tilføje 500 µL af 1,2 M sorbitol til hver tube, resuspend cellerne, og indsamle alle cellerne i en 15 ml konisk tube.
- Tilføje 1,2 M sorbitol op til 2,4 mL (OD600 = 10 pr. 0,2 mL). Hold røret på is.
- Tilføje 200 µL af sorbitol-suspenderet celler (Sørg for de er helt suspenderet) til en EP rør indeholdende fusion PCR konstruere, bland godt og overføre prøven til en electro-kuvette.
- Electroporate celler med følgende indstillinger: svampe, ShS (2.00kV, 1 puls).
- Tilføje 600 µL af 1,2 M sorbitol til hver electro-kuvette for en samlet maengde paa 800 µL, og derefter sprede celler på fire ja plader (200 µL/plade). Ti electro-kuvetter vil dispensere til 40 ja plader.
- Inkuber plader ved 30 ° C i 24 timer.
- Udføre kopi plade til Ja + G418 og inkuberes plader ved 30 ° C i 3 dage.
8. valg af Heterochromatin-destabiliserende mutanter og kontrol af falske positiver
- For hver ja + G418 plade, udføre kopi plade til Ja-Ade (lav Ade) og PMG-Ade (No Ade) plader. Inkuber replika plader i 1-2 dage ved 30 ° C, indtil nogle af kolonierne på Ja-Ade pladerne viser en rød farve (figur 1 g).
- Sammenlign ja-Ade og PMG-Ade plader og marker celler, der viser pink eller hvid på Ja-Ade plade og også vokse på PMG-Ade plade. Skal du ikke markere kolonier uden vækst på PMG-Ade, som de er falske positiver (f.eks., hvilket afspejler, at KAN kassetten er blevet integreret på en ikke-målarter sted andre steder i genomet).
- Pluk ca 1 x 105 celler fra hver koloni og inkuberes i 10 µL af SPZ løsning indeholdende 2,5 mg/mL zymolyase 100 T ved 37 ° C i mindst 30 min. Brug 1 µL af denne løsning til at udføre som udgangspunkt skabelon for kolonien PCR (figur 1 H).
- Lav SPZ (50 mL) ved at blande 30 mL 2 M sorbitol, 4.05 mL 1 M Na2HPO4, 0,95 mL NaH2PO4 og 15 mL destilleret vand (endelige pH, 7.5). Prøver (5 mL) kan suppleres med zymolyase og gemt i 500 µL alikvoter ved-20 ° C indtil brug.
- Udføre gelelektroforese (1,2% agarosegel, 180V, 20 min) for at visualisere resultatet af + koloni PCR. Vælg reaktioner, som udviser PCR bands af passende størrelse og fordøje 5 µL af hver reaktionsprodukt med Xhojeg (4 U enzym, 1 x fordøjelsen buffer, 37 ° C vandbad, 1 h) til at frasortere falske positiver (figur 1 H).
- Udføre gelelektroforese for at visualisere XhoI fordøjer (1,2% agarosegel, 180 V, 20 min). Markere kolonier hvis PCR produkter er skåret af XhoI, og lappe dem til Ja + G418 plader (figur 1I).
- Isolere gDNA fra fission gærceller og udføre sekventering af PCR produkter23. Sammenligne de opnåede sekvens med vildtype sekvens til at identificere mutationer (figur 1I).
- Re indføre direkte mutation(s) til wild-type celler ved at forvandle dem med fusion konstruktioner forstærkes ved PCR fra muterede celler23. Bruge spotting for at bekræfte fænotype i de nylavede muterede celler (figur 1J).
- Fusion transformation konstruktion kan nemt forstærkes ved PCR primere p1 og p10 ved hjælp af mutanter genomisk DNA som skabelon i en samlet maengde paa 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x reaktion buffer), og anvende de reaktion cyklusser beskrevet i tabel 2 . Transformation af konstruktionen kan gøres ved at følge trin 7.1-7.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De erhvervede Rpt4 mutanter ved at følge de procedurer, der er beskrevet i figur 1 kan analyseres ved at vurdere farver i kolonierne. Farverne på kolonierne er spottet på de relevante plader i faldende celle nummer i figur 2. Ade6 + reporter indsat på heterochromatin området er tavshed i wild-type og viser rød kolonier i ja-Ade plade. Når heterochromatin er destabiliseret og ade6 + reporter udtrykkes, kan hvide kolonier observeres i ja-Ade plade som clr4Δ mutant. De screenede Rpt4 mutanter er som vist. rpt4-1 mutant viser de mest alvorlige heterochromatin destabilisering.
Figur 1 : Skematisk fremstilling af protokollen. (A) skematisk gengivelse af PCR produkt fremstillet ved første runde af PCR, som er udført med primere 1 og 2. (B) softwarebegrænsning-baserede kloning af rpt4 + fragment. (C) Site-directed mutagenese af de klonede vektor er brugt til at indføre en tavs mutation, der tilføjer en XhoI begrænsning site. (D) tilfældig mutagenese af den rpt4 + kodning region udføres ved hjælp af fejlbehæftede PCR. (E) det muterede rpt4 + fragment, KAN fragment, og 3' UTR fragment er følgeskab af fusion PCR til at generere en transformation-ready kassette. (F) Fission gærceller er transformeret med fusion PCR konstruktion, som erstatter den endogene rpt4 + sekvens af homologe rekombination. (G) KAN-udvalgte kolonier er replika forgyldt til Ja-Ade (lav Ade) og PMG-Ade (No Ade) plader, og positive kolonier er valgt. (H) PCR og efterfølgende XhoI begrænsning af PCR-produktet bruges til at undgå falske positiver. (I) den mutation, der forårsager fænotype er identificeret af lappe valgte kolonier, formering af celler, udvinding af genomisk DNA (gDNA) og sekventering af den relevante del af rpt4 +. (J) forårsagende mutationer er bekræftet (og falske positiver er udelukket) ved direkte at indføre mutation til wild-type celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Heterochromatin de undertrykkelse mutanter af Rpt4. Skematisk diagram over otr1::ade6 + reporteren (øverst). 5-fold serielle fortyndinger af Vælg screenede Rpt4 mutanter blev spottet på de angivne plader i rækkefølge efter stigende niveau af heterochromatin destabilisering (nederst). Dette tal blev ændret fra artiklen '19S proteasom er direkte involveret i reguleringen af heterochromatin spredning i fission gær' af Seo et al., 201724. Figuren ikke beskåret kan findes i den oprindelige artikel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Komponent | Type af plade | |
| Ja | PMG | |
| Gærekstrakt | 5 g/L | |
| Glukose | 30 g/L | 20 g/L |
| Adenin | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Histidin | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Leucin | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Uracil | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Kalium brint pthalate | 3 g/L | |
| Na2HPO4 | 2,2 g/L | |
| L-glutaminsyre | 3.75 g/L | |
| Salte | 20 ml/L | |
| Vitaminer | 1 ml/L | |
| Mineraler | 0,1 ml/L | |
| Agar | 16 g/L | 16 g/L |
Tabel 1. Komponenter af ja og PMG plader
| Temperatur | Tid | Cyklusserne |
| 95oC | 2 min | 1 cyklus |
| 95oC | 20 s | 30 cykler |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 min | |
| 72oC | 8 min | 1 cyklus |
| 8oC | Hold |
Tabel 2. Anbefalede PCR program for site-directed mutagenese
| Temperatur | Tid | Cyklusserne |
| 95oC | 2 min | 1 cyklus |
| 95oC | 30 s | 19 cykler |
| 55oC | 1 min | |
| 72oC | 7 min | |
| 72oC | 10 min | 1 cyklus |
| 8oC | Hold |
Tabel 3. Anbefalede PCR program for fejlbehæftet PCR
| Temperatur | Tid | Cyklusserne |
| 95oC | 2 min | 1 cyklus |
| 95oC | 20 s | 30 cykler |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 min | |
| 72oC | 8 min | 1 cyklus |
| 8oC | Hold |
Tabel 4. Anbefalet PCR program for at opnå KAN fragmentet
| Ændring | Til | Eksempel tilfældet med rpt4 + | |
| Skabelon vektor | pFA6a-3HA-KANMX6 | ||
| Vektor-bindende sekvens af p7 | ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | ttgctgacctgaagaaacttgaaggtacaattgattaccaaaagctttag ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | |
| Hængende sekvens af p7 | Den sidste 50bp sekvens herunder stop-codon | ||
| Hængende sekvens af p8 | Den første 50bp sekvens lige efter stop codon (supplerende sekvens) | AATCTTCATCGGTAAACTTATCATTTCATGGCTTTTTGGATATATGTGCA GAATTCGAGCTCGTTTAAAC | |
| Sekvens af p9 | Start lige efter stop-codon | tgcacatatatccaaaaagccatgaa | |
| Sekvens af p10 | Producere ~ 500bp fragment med p9 (supplerende seqeucne) | TAGACGTTTTTCCTCGTTTCTTTGTC | |
Tabel 5. Ændringer nødvendige, når ADH terminator bruges i stedet for den endogene terminator
| Temperatur | Tid | Cyklusserne |
| 95oC | 2 min | 1 cyklus |
| 95oC | 20 s | 30 cykler |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 1 min | |
| 72oC | 8 min | 1 cyklus |
| 8oC | Hold |
Tabel 6. Anbefalet PCR program for at opnå 3' UTR fragmentet
| Temperatur | Tid | Rampe | Cyklusserne |
| 94oC | 2 min | 1 cyklus | |
| 94oC | 20 s | 10 cykler | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0,1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 min | 0.2 oC/s | |
| 94oC | 20 s | 5 cykler | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0,1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 min | 0.2 oC/s + 5 s/cyklus | |
| 94oC | 20 s | 10 cykler | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0,1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 min | 0.2 oC/s + 20 s/cyklus | |
| 72oC | 10 min | 1 cyklus | |
| 8oC | Hold |
Tabel 7. Anbefalede PCR programmet for fusion PCR
| CBL1877 | h + | ade6-210 leu1-32 ura4-D18 otr1R (GD-glu) Sph1:ade6 |
Tabel S1: Stamme anvendes i denne undersøgelse
Tabel S2: Liste over primere, der anvendes i denne undersøgelse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilfældig mutagenese via fejlbehæftet PCR er et kraftfuldt værktøj til at generere en forskelligartet gruppe af mutanter i en given region. Denne teknik er især nyttig for undersøgelser, der forsøger at vurdere funktionen af en protein under en bestemt omstændighed. For eksempel, brugte vi heri fejlbehæftet PCR for at vurdere funktionen af 19S proteasom subunit, Rpt4, i heterochromatin vedligeholdelse. Ved at variere regionen målrettet af fejlbehæftede PCR og justere screening betingelser, vi var i stand til at mutere celler ved genomisk region af interesse og skærmen til den ønskede fænotype. For nylig blev en lignende metode brugt til at isolere fission gærceller husly mutationer i spindel pole krop komponent25.
Den vigtigste fordel ved tilfældig mutagenese er, at det kan anvendes til både ikke-væsentlige og væsentlige gener. Tilfældig mutagenese af væsentlige gener kan give forskellige mutanter, såsom dem med subtile og/eller delvis funktionelle defekter, der giver mulighed for cellernes levedygtighed skal opretholdes, eller mutanter hvis funktioner berøres kun under en bestemt betingelse. Et eksempel på sidstnævnte er en mutant, temperatur-følsomme. Sådanne mutanter kan isoleres ved hjælp af 5 mg/L phloxine B, som pletter døende celler i rødt og gør det langsomt voksende celler kan skelnes fra døende celler26.
Den kritiske trin i denne protokol er det fejlbehæftede PCR skridt. På dette trin er det vigtigt at kontrollere mutation frekvens, som kan variere meget afhængigt af antallet af PCR cyklusser og det oprindelige beløb af skabelon. Vi anbefaler, at brugeren fastsættes antallet af PCR cykler og varierer de beløb på skabelon, som vi fandt dette at være en mere praktisk strategi for optimering. Vi noterer, at teknikken med fejlbehæftet PCR har været almindeligt tilgængelig i årtier. Hvis brugeren vælger, kan de søge en metode til manuelt udfører fejlbehæftede PCR27 uden brug af et kommercielt tilgængelige mutagenese kit.
Som en forsigtig er de falsk positive rate af denne protokol forholdsvis høj. Således skal mutant kandidater gennemgå en række screeninger beregnet til at luge ud i de falske positiver. Vi fandt, at silent inkorporering af en restriktion site i target-genet kan hjælpe undgå behovet for at emnet falske positiver til relativt omstændelig trin af sekventering. Dette er omkostningseffektiv, som de mutante kandidater kan nummer i hundreder eller endog længere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Finansiering støtte til dette projekt blev leveret af den grundlæggende videnskab forskningsprogram gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab og IKT (2016R1A2B2006354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Cohen, J.
- Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
- Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
- Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
- Grewal, S. I., Jia, S.
- Forsburg, S. L. Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html (2011).
- QIAquick PCR Purification Kit. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation (2013).
- pBlueScript II Vector. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115& (2005).
- QIAquick Gel Extraction Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation (2013).
- QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2 (2016).
- PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136 (2004).
- Gibson Assembly Master Mix. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information (2017).
- GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057 (2012).
- Plasmid Plus Midi Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/ (1999).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
- Nurse, P. Fission Yeast Handbook. , https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx (2000).
- Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
- Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
- Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
- Wilson, D. S., Keefe, A. D.
