Murine spyt funktionel vurdering via pilocarpin Stimulation følgende fraktioneret stråling
Summary
Vi præsenterer en detaljeret tilgang til udførelse af spyt samling, herunder murine trakeostomi og isolation af tre store spytkirtler.
Abstract
Hyposalivation er almindeligt observeret i den autoimmune reaktion af Sjögrens syndrom eller følgende stråling skade de store spytkirtler. I disse tilfælde forbliver spørgsmål vedrørende sygdom patogenese og effektive interventioner. En optimeret teknik, der giver mulighed for funktionel vurdering af spytkirtlerne er uvurderlig for at undersøge eksokrine kirtel biologi, dysfunktion og terapi. Vi præsenterer her, en trinvis tilgang til udfører pilocarpin stimuleret spyt sekretion, herunder trakeostomi og dissektion af de tre store murine spytkirtler. Vi detalje også den passende murine hoved og hals anatomi adgang til under disse teknikker. Denne tilgang er skalerbart, giver mulighed for flere mus skal behandles samtidig, dermed forbedre effektiviteten i arbejdsgangen. Vi sigter mod at forbedre reproducerbarhed af disse metoder, hver har yderligere programmer inden for feltet. Ud over spyt indsamling diskuterer vi målinger til kvantificering og normalisere funktionelle kapacitet af disse væv. Repræsentative data medtages fra submandibulære kirtler med deprimeret spytkirtel funktion 2 uger efter fraktionerede stråling (4 doser af 6.85 Gy).
Introduction
Spytkirtel lidelser omfatter syndromer af dysregulated eller nedsat sekretion fører til overproduktion (sialorrhea) eller underproduktion (xerostomia og hyposalivation) af spyt1. I begge tilfælde er der en interesse i at forbedre vores forståelse af spytkirtel biologi mod det endelige mål for terapeutisk udvikling2.
Spytkirtlerne er stærkt radiosensitive organer, og er ofte beskadiget under hoved og hals kræft strålebehandling, fører til permanent mundtørhed (xerostomia)3,4. I modsætning til andre radiosensitive væv, dog spytkirtel omsætning sats er relativt lav, og mekanismen af sekretoriske tab er dårligt forstået5,6. I indstillingen unikke skade kræver væv regeneration og strålingsbeskyttelse strategier spyt funktionel vurdering. Eksperimentelt, er murine spyt samling et særligt værdifuldt værktøj i evaluering kirtel svar på både stråling og terapeutiske agenter.
Vi præsenterer her, en metode til udførelse og kvantificere stimuleret spyt sekretion ved hjælp af pilocarpin, en potent muskarine agonist7. Pilocarpin stimulerer det autonome nervesystem for at fremkalde kirtel sekretion8,9. For at fuldføre denne test passende, er en trakeostomi forpligtet til at sikre, at musen fastholder en patent luftvejene under hele proceduren og reducere risikoen for kvælning og aspiration fra poolede sekret i mundhulen10.
Dette er en terminal procedure, som kulminerede i fjernelsen af de tre store spytkirtler: parotideale (PG), de submandibulære (SMG) og sublinguale (SLG). For funktionelle studier, kirtel vægte registreres og bruges ofte til at normalisere spyt måling11,12,13. Disse data er særlig vigtig i stråling undersøgelser, hvori kirtel atrofi er en forventet resultat14,15
Der er variation i litteratur med hensyn til hvordan stimuleret spyt sekretion er udført og rapporteret16. For eksempel, pilocarpin doser inden for litteratur span mindst tre størrelsesordener17,18,19,20,21,22,23. Her præsenterer vi en optimeret højdosis pilocarpin protokol med hensigten at bedre reproducerbarhed i Metodekørsel, samt give en modulær platform af teknikker (tracheostomi, spyt samling og kirtel dissektion), der kan tilpasses nødvendig.
Ud over protokollen demonstration medtager vi repræsentative funktionelle data af spyt flow på 2 uger efter fraktionerede stråling (4 doser af 6.85 Gy) til regionen SMG.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenterer en omstændelig metode til at vurdere spytkirtel-funktion, som kan anvendes til at studere kirtel skade og therapeutics. Vores procedure indebærer tracheostomi, spyt samling og kirtel dissektion, hver har eksperimentelle programmer, der kan understøtte en integreret undersøgelse af spytkirtel biologi. For eksempel, er murine trakeostomi blevet brugt for generelle airway management under procedurer blokerer mundhulen.
Ordentlig dissektion og luftrør indsnit kræves for piloc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af den nationale Dental-Institut og Craniofacial forskning (NIDCR) og National Cancer Institute (NCI) af National Institutes of Health under Award antallet R56 DE025098, UG3 DE027695 og F30 CA206296. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health. Dette arbejde blev også støttet af NSF DMR 1206219 IADR Innovation i Oral Care Award (2016).
Vi vil gerne takke Dr. Eri Maruyama og Andrew Hollomon for deres hjælp med spyt samling. Vi vil gerne takke Pei-Lun Weng for hans hjælp med kirtel dissektion. Vi vil gerne takke Matthew Ingalls for sin bistand i figur forberedelse. Vi vil gerne takke Dr. Elaine Smolock og Emily Wu for kritisk læsning af dette manuskript.
Materials
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
- Bradley, P., O’Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
- Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
- Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).
- Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication. Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).
- Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both?. Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).
- Ono, K., et al. Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats. Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).
- Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals. Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).
- Urita, Y., et al. Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation. North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Kondo, Y., et al. Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands. Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).
- Evans, R. L., et al. Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).
- Delanian, S., Lefaix, J. L. The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway. Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).
- Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment. Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).
- Lin, A. L., et al. Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Montenegro, M. F., et al. Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research. Redox biology. 10, 206-210 (2016).
- Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model. Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).
- Imamura, T. K., et al. Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).
- Ma, T., et al. Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels. Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).
- Parkes, M. W., Parks, J. C. Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse. British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).
- Nishiyama, T., et al. Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516 (2007).
- Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).
- Kamiya, M., et al. X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses. BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).
- Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).
- Droebner, K., Sandner, P. Modification of the salivary secretion assay in F508del mice–the murine equivalent of the human sweat test. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).
- Lamy, E., et al. Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet. Proteome Science. 8 (1), 65 (2010).
- Mahomed, F. Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).
- Kohlgraf, K. G., et al. Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay. Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).
- Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells. Radiotherapy and Oncology. , (2015).
- Lombaert, I. M., et al. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. PLoS One. 3 (4), e2063 (2008).
