Мышиных слюнных функциональной оценки через после стимуляции пилокарпин фракционированный излучения
Summary
Мы представляем детальный подход к выполнению сбора слюны, включая мышиных трахеостомические и изоляции трех основных слюнных желез.
Abstract
Гипосаливация обычно наблюдается в аутоиммунные реакции Шёгрен синдром или следующие травмы излучения в больших слюнных желез. В этих случаях остаются вопросы относительно патогенеза заболевания и эффективных мероприятий. Оптимизированный метод, который позволяет функциональной оценки слюнных желез имеет неоценимое значение для изучения биологии экзокринной железы, дисфункции и терапии. Здесь мы представляем шаг за шагом подход к выполнению пилокарпин стимулирует секрецию слюны, включая трахеостомические и рассечение трех основных мышиных слюнных желез. Мы также подробно соответствующие мышиных анатомия головы и шеи, доступны во время этих методов. Этот подход является масштабируемой, позволяя для нескольких мышей, чтобы быть обработаны одновременно, повышая эффективность работы потока. Мы стремимся улучшить воспроизводимость этих методов, каждый из которых имеет дополнительные приложения в пределах области. Помимо сбора слюны мы обсуждаем метрики для количественной оценки и нормализации функционального потенциала этих тканей. Репрезентативных данных включены от подчелюстной желез с функцией депрессии слюнной железы 2 недель после фракционированный излучения (4 дозы 6.85 гр).
Introduction
Нарушения слюнной железы включают синдромы dysregulated или нарушением секреции приводит к перепроизводству (sialorrhea) или недопроизводства (ксеростомия и гипосаливация) слюны1. В обоих случаях существует заинтересованность в улучшении нашего понимания слюнных желез биологии к конечной цели терапевтического развития2.
Слюнные железы являются весьма радиочувствительным органов и часто повреждены во время радиотерапии рака головы и шеи, приводит к постоянной сухость во рту (ксеростомия)3,4. В отличие от других радиочувствительным тканей однако, текучесть слюнных желез является относительно низким, и механизм секреторной потери является плохо понимали5,6. В этой обстановке уникальный травмы, ткани регенерации и радиационной безопасности стратегии требуют слюнных функциональной оценки. Экспериментально мышиных слюны коллекции является особенно ценным инструментом в оценке железы ответ к радиации и терапевтических агентов.
Здесь мы представляем метод для выполнения и количественного определения секреции стимулировали слюны, с помощью пилокарпин, мощным мускариновых агонист7. Пилокарпин стимулирует вегетативную нервную систему, чтобы побудить железы секреции8,9. Надлежащим образом выполнить этот тест, трахеостомические требуется обеспечить, что мышь поддерживает патент сократимость во всей процедуре и уменьшить риск удушья и аспирации от пула выделениями в полости10.
Это терминал процедура, кульминацией удаления трех основных слюнных желез: околоушной (PG), подчелюстной (SMG) и сублингвально (SLG). Для функциональных исследований записываются и часто используются для нормализации слюны измерения11,12,13железы весов. Эти данные особенно важна в радиационных исследований, которой атрофию желез является ожидаемый результат14,15
Изменчивость в литературе в отношении как стимулируется секреция слюны производится и сообщил16. Например пилокарпин дозы в литературе диапазона по меньшей мере трех порядков17,18,19,20,21,22,23. Здесь мы представляем оптимизированные высокие дозы пилокарпин протокола с целью улучшения воспроизводимость результатов выполнения метода, а также предоставление модульной платформы методов (трахеостомические, сбора слюны и железы рассечение), которые могут быть адаптированы, как требуется.
Помимо протокола демонстрации мы включить представителя функциональные данные слюны потока на 2 недели, после фракционированный излучения (4 дозы 6.85 Gy) в регионе SMG.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представляем многоступенчатое метод для оценки функции слюнных желез, которые могут быть применены для изучения травмы железы и терапии. Наша процедура включает трахеостомические, сбора слюны и железы рассечение, каждая из которых имеет экспериментальных приложений, которые могут…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в этой публикации было поддержано Национального Института стоматологии и челюстно-лицевой исследований (NIDCR) и национального института рака (NCI) национальных институтов здравоохранения под награду номер R56 DE025098, UG3 DE027695 и F30 CA206296. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья. Эта работа была также поддержана NSF DMR 1206219 и получила инновации в устной Уход награды (2016).
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Eri Маруямы и Эндрю Холломон за их помощь в сборе слюны. Мы хотели бы поблагодарить Пей-Lun Weng за его помощь в железе рассечение. Мы хотели бы поблагодарить Мэтью Ingalls за его помощь в подготовке рис. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Элейн Smolock и Эмили Ву для критических чтении этой рукописи.
Materials
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
- Bradley, P., O’Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
- Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
- Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).
- Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication. Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).
- Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both?. Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).
- Ono, K., et al. Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats. Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).
- Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals. Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).
- Urita, Y., et al. Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation. North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Kondo, Y., et al. Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands. Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).
- Evans, R. L., et al. Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).
- Delanian, S., Lefaix, J. L. The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway. Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).
- Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment. Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).
- Lin, A. L., et al. Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Montenegro, M. F., et al. Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research. Redox biology. 10, 206-210 (2016).
- Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model. Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).
- Imamura, T. K., et al. Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).
- Ma, T., et al. Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels. Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).
- Parkes, M. W., Parks, J. C. Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse. British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).
- Nishiyama, T., et al. Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516 (2007).
- Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).
- Kamiya, M., et al. X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses. BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).
- Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).
- Droebner, K., Sandner, P. Modification of the salivary secretion assay in F508del mice–the murine equivalent of the human sweat test. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).
- Lamy, E., et al. Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet. Proteome Science. 8 (1), 65 (2010).
- Mahomed, F. Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).
- Kohlgraf, K. G., et al. Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay. Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).
- Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells. Radiotherapy and Oncology. , (2015).
- Lombaert, I. M., et al. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. PLoS One. 3 (4), e2063 (2008).
