Дрозофилы In Vivo травмы модель для изучения Neuroregeneration в периферической и центральной нервной системы
Summary
Здесь мы представляем протокол, с помощью дрозофилы сенсорного нейрона – дендритных арборизация (da) нейронных травмы модель, которая сочетает в себе в естественных условиях живут изображений, два фотона лазерного axotomy/dendriotomy и мощный летать генетических элементов, как Платформа для отбора потенциальных промоутеров и ингибиторов neuroregeneration.
Abstract
Количество поврежденных нейронов отрастания управляет neuroregeneration и функциональное восстановление после травмы нервной системы. За последние несколько десятилетий были определены различные внутренние и внешние ингибирующих факторов в ограничение регенерации аксона. Однако просто удалив эти ингибирующих сигналов недостаточно для успешной регенерации, указывающие на дополнительные механизма регулирования. Drosophila melanogaster, плодовая муха, разделяет эволюционно сохранены генов и сигнальных путей с позвоночных животных, включая человека. Сочетание мощного генетических элементов мух с двух фотона лазерного axotomy/dendriotomy, мы опишем здесь дрозофилы сенсорные нейрон – дендритных арборизация (da) модель нейрона травмы как платформы для систематического досмотра для Роман Регенерация регуляторы. Вкратце эта парадигма включает в себя) подготовку личинки, индукция b) поражением dendrite(s) или axon(s) с использованием двух фотона лазерного, c) живой конфокальный изображений после травмы и d) анализа данных. Наша модель позволяет высокую воспроизводимость травмы одного помечены нейронов, аксонов и дендритов четко определенных нейронов подтипы, в периферической и центральной нервной системы.
Introduction
Неспособность аксоны восстанавливаться после травмы центральной нервной системы (ЦНС), может привести к постоянной инвалидности в больных, а также играет роль в необратимое неврологического дефицита в нейродегенеративных заболеваний1,2 ,3,4,5. CNS окружающей среды, а также способность внутреннего роста нейронов, определяет ли аксоны способны восстанавливаться после травмы. Было показано, что внеклеточных факторов от олигодендроциты, астроглиальных и фибробластический источников препятствуют нейрональных роста4,6,7,8, но ликвидации этих молекул разрешает только для ограниченной прорастания5. Внутренней регенерации сигналы могут влиять регенеративной успеха5,9 и представляют потенциальных терапевтических целей, но эти процессы еще не четко на молекулярном уровне. Увеличение трофического фактора сигнализации или ликвидация эндогенных тормоза, например Pten фосфатазы10, может привести к аксональное регенерации в определенных обстоятельствах. Комбинации различных методов оказывается индивидуально эффективной обеспечивают также только ограниченное общее восстановление на сегодняшний день11,12,,1314. Таким образом есть отчаянная необходимость определить дополнительные пути для целенаправленной терапии. Помимо начала отрастания аксона ли и как аксоны повторно провод правильную цель, реформы синапса специфичность и добиться восстановления функций являются важные нерешенные вопросы.
Таким образом нынешнее понимание механизма, диктуя регенерации аксона до сих пор весьма фрагментарно. Частью проблемы является технической сложности изучения аксона регенерации в организме млекопитающих в режиме реального времени, подход, который является дорогостоящим, длительным и сложным для проведения крупномасштабных генетических экраны. Drosophila melanogaster, с другой стороны, оказалась исключительно мощные системы для изучения сложных биологических вопросов. Плодовая муха сыграла важную роль в определении генов и сигнальные пути, которые поразительно сохраняются в организме человека и была успешной моделью для изучения человека условий, таких как нейродегенеративных заболеваний, через инструменты огромной молекулярной генетики доступно для манипулирования генов функция15. В частности дрозофил считаются идеальным инструментом для обнаружения генов, участвующих в нейронных травмы и отрастания15,16. Были разработаны несколько моделей летать нейронных травмы, включая взрослых руководитель или личинок воспалении брюшины шнур (VNC) ножом с иглами, личинок VNC или раздавить нерва с щипцами, личинок нейрон лазер axotomy, удаление нейрон обонятельного рецептора, мозг эксплантов травмы, и поражения периферических нервов, крыло выходное15,17,18,19,20,21,,2223. Возбуждающе последние работы используя дрозофилы травмы модели продвинули наше понимание клеточной и генетической путей, используемых в нервной системе реагировать нейронных травмы, некоторые из которых было показано, быть сохранены в млекопитающих24 ,25. Опять же это подчеркивает полезность этой модели организма для определения новых механизмов нейронных ремонта.
Описанные здесь — это двух Фотон лазерных дрозофилы личиночной сенсорных нейронах травмы модель. Двух фотона лазерного был впервые использован для резки аксоны в zebrafish в естественных условиях в 2003 году26. В том же году первый dendriotomy лазера была исполнена в дрозофилы с помощью лазерной импульсной азота27. Вскоре после этого несколько C. elegans лаборатории используется для определения модели регенерации аксона28фемтосекундных лазеров. В 2007 году Ву и коллеги по сравнению и сообщил различия между лазерной травм в C. elegans индуцированных различные виды лазеров29. В 2010 году регенерации аксона после лазерной axotomy был впервые показан в дрозофилы30. Опираясь на эту литературу травмы обширная лазерная, мы разработали модель fly нейронных травмы с помощью двух Фотон лазер, который позволяет точно индукции травмы на целевые сайты с минимальными возмущений соседних тканей, обеспечивая относительно чистым системы для изучения внутренние и внешние свойства neuroregeneration с одной ячейкой резолюции. В частности, мы создали набор методов травмы для сенсорных нейронов дендритных арборизация (da) в обоих периферической нервной системы (ПНС) и ЦНС. Да нейроны могут быть сгруппированы в четыре различных класса, главным образом отличают их сложности разветвления дендритов: класс I до IV31. Наша опубликованные работы показывает, что да нейрон регенерации напоминает млекопитающих травмы модели на фенотипическую и молекулярном уровне: Да нейронов отображать свойства класса конкретных регенерации, с класса IV, но не класса I или III да нейронов экспонируется регенерации в ПНС; Класс IV да нейрон аксоны регенерировать надежно на периферии, но их регенеративный потенциал резко сократилось в ЦНС, таким образом, напоминающие Спинной корень нейроны ганглии (DRG) млекопитающих; повышение активности mTOR через Pten удаления или Akt гиперэкспрессия способствует регенерации аксона в лету ЦНС19. Используя эту модель травмы, мы выполняют генетических экраны и определили обработки фермент РНК Rtca как эволюционно сохранены тормозящий фактор для регенерации аксона, связывание аксона травмы клеточного стресса и изменения РНК20 .
В представленных парадигме травмы индуцируется через лазерной axotomy/dendriotomy личинок класса IV или III да нейронов, обозначены ППК CD4-tdGFP или 19-12-Gal4, бас-CD4-tdGFP, репо Gal80, соответственно. Травмы осуществляется на 2-й до 3rd instar личинок на около 48-72 ч после откладки яиц (h AEL). Для ПНС axotomy поражения предназначена для секции аксона ~ 20-50 мкм от клеток тела, для ЦНС axotomy площадью ~ 20 мкм в диаметре на стыке спайки в VNC и dendriotomy точки первичных дендритных филиала. Же нейрон отображаемого в 8-24 ч после травмы (AI), для подтверждения полного перерезка и на 48-72 ч AI для оценки регенерации. Через промежуток времени конфокальная томография, со временем может контролироваться дегенерация и регенерации отдельных аксоны/дендритов, которые были потерпевшего в естественных условиях .
Protocol
Representative Results
Discussion
При настройке покупать кресты, количество самок и самцов используемые может варьироваться в зависимости от генотипов и количество личинок, необходимые для конкретных экспериментов. Для WT мух типичный кросс использует 10 женщин и 5 мужчин. Окно коллекции может быть сокращен, в зависимос?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Джессика Гольдштейн для технической поддержки. Работа в лаборатории песня финансируется NIH Грант R00NS088211 и интеллектуальный и отклонениями в исследовательский центр (IDDRC) новой программы развития премии.
Materials
| Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous | Acros Organics | AC615080010 | |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | 59-133 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L | VWR | 97062-948 | |
| Agar powder, Alfa Aesar, 500GM | VWR | AAA10752-36 | |
| Grape juice | Welch’s | ||
| Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) | VWR | 64-17-5 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Propionic Acid | J.T.Baker | U33007 | |
| Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544-D | 50 mm X 22 mm |
| Zeiss LSM 880 laser scanning microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Chameleon Ultra II | Coherent |
Riferimenti
- Yakura, J. S. . Recovery following spinal cord injury. , (1996).
- Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury?. Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
- Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. , (2010).
- Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
- Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
- He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
- Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
- Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
- Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
- Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
- MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
- Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
- Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
- McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
- Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
- Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
- Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. , (2011).
